吹扫捕集/气相色谱-质谱联用测定人体尿液中丙酮含量

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(1.中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室，湖北武汉 430074；2.中国地质大学(武汉)材料与化学学院，湖北武汉 430074；3.中国地质大学(武汉)地质过程与矿产资源国家重点实验室，湖北武汉 430074)

随着人们生活水平的提高，糖尿病在世界范围内的发病率不断上升，已经成为仅次于心血管疾病、癌症之后危害人类健康的第三大疾病[1 - 2]。糖尿病是一组以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢疾病，多数发病缓慢，症状相对较轻，半数以上无任何症状。诊断糖尿病时，常发现患者可能已有5～10年的病程，已存在血管并发症，尤其是动脉粥样硬化性心、脑血管病。因此，及时、准确地检测人体血糖浓度对于糖尿病的早期诊断和治疗显得十分重要[3 - 4]。目前临床上常以测定患者血液中血糖的浓度和糖化血红蛋白值来诊断糖尿病及其病程。该方法是一种侵入式的测定方法，需要采集被测患者的血液，给患者带来极大的痛苦，且操作较复杂、测试周期较长，同时也存在院内感染的风险[5 - 7]。

研究表明，糖尿病患者在血糖浓度升高前，尿液中丙酮的浓度会明显的升高，因此通过测定尿液中的丙酮含量，有可能获得糖尿病病程发展的相关信息，对于糖尿病的早期预警有着重要意义[8]。丙酮具有高度的挥发性和活性，在实际分析的过程中很容易损失，而且尿液基质比较复杂，基体干扰严重，特别是尿液中丙酮的浓度较低时，对其进行直接检测存在很大的困难。目前，临床上常用酮体粉[9]、尿十项分析仪检查尿液中丙酮，根据颜色进行诊断，检测过程简易快速，但因为影响因素较多，只能得到一个半定量结果，容易诊断为假阳性[10]。

吹扫捕集技术由于灵敏度高、检出限低等优点而被广泛应用于挥发性化合物的富集检测。该技术适用于液体或固体样品中沸点低(<200℃)、溶解度小的挥发性或半挥发性有机物的萃取，广泛用于食品与环境监测、临床化验等领域[11 - 13]。黄毅[14]等采用吹扫捕集/气相色谱-质谱(GC-MS)方法测定尿液中的丙酮，获得较好的效果，但只是定性方法。Liu[15]等采用吹扫捕集/GC-MS方法测定了水体中的挥发物。目前关于吹扫捕集/GC-MS定量测定尿液中丙酮的方法少见报道。本研究考虑尿液的基质特性，引入201-二甲基硅油作为尿液消泡剂，将吹扫捕集前处理方法与GC-MS联用，建立了一种快速、灵敏检测尿液中丙酮含量的新方法。通过准确测定糖尿病患者尿液中丙酮的含量来判断其病程，为糖尿病的及时诊断和早期预警提供帮助。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC-MS/QP2010Plus气相色谱-质谱联用仪(日本，岛津公司)；Eclips4660-Purge&TrapSampleConcentrator吹扫捕集仪(美国，0I公司)；4551自动进样器(美国，0I公司)，5mL芯式吹扫管(美国，0I公司)，10#捕集阱(Texan/硅胶/碳分子筛)(美国，0I公司)；气相色谱微量进样器(5μL，上海高鸽工贸有限公司)；磁力加热搅拌器(江苏金坛大地自动化仪器厂)；ME235P型十万分之一电子天平(德国，sartorius天平)；101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

丙酮(色谱纯)，201-二甲基硅油(分析纯)，磷酸三丁酯(分析纯)。水为去离子水。

糖尿病病人及正常人尿样由中国地质大学(武汉)医院提供。

1.2 标准溶液的配制

采用1000μL的移液枪，精确移取632μL丙酮溶液于500mL的容量瓶中，以去离子水稀释至刻度，即得到浓度为1000mg/L的丙酮储备溶液。采用逐步稀释的方法，制备浓度分别为20、40、50、80、100μg/L的丙酮标准系列1，以及200、400、600、800、1000μg/L的丙酮标准系列2。所有配制好的标准溶液均用聚四氟乙烯膜密封，并将其放置于4℃冰箱中，避光保存。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：Rtx-WAX石英毛细管色谱柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm，美国RESTEK公司)；载气为高纯氦气(99.999%)，流量lmL/min；进样口温度250℃；进样方式为分流进样，分流比为20∶1；升温程序：初温40℃，保持1min，以40℃/min升至200℃，保持2min。

质谱条件：EI源：电离电压：70eV；接口温度280℃；离子源温度260℃；Scan模式采集：m/z：45～100；SIM模式采集：m/z：58、43、39，以峰面积定量。吹扫捕集条件：吹扫气体：高纯氮气(99.999%)；六通阀箱温度：40℃；传送线温度：250℃；水管理器：100℃；吹扫管座：50℃。

2 结果与讨论

2.1 吹扫捕集/GC-MS条件优化

2.1.1GC柱温选择适当提高柱温有利于加快传质过程、提高分析速度而改善柱效。但柱温太高又会增大扩散系数而降低柱效。研究中采用四种不同的程序升温方法：(1)初始温度45 ℃，保持2 min，然后以速率10 ℃/min，升高到最终温度100 ℃；(2)色谱柱初始温度45 ℃，然后以速率20 ℃/min，升高到最终温度100 ℃；(3)色谱柱初始温度45 ℃，然后以速率30 ℃/min，升高到最终温度180 ℃；(4)色谱柱初始温度40 ℃，然后以速率40 ℃/min，升高到最终温度200 ℃，保持1 min。结果显示：最佳升温程序是起始温度为40 ℃，然后以40 ℃/min的速率升到200 ℃，保持1 min。

2.1.2吹扫时间的选择在对丙酮标准溶液的吹扫捕集进样分析中，适当增加吹扫时间可使丙酮组分能从溶液中被充分的吹扫出来并吸附在捕集阱上，因此可以提高方法的灵敏度。但其在捕集阱上存在吸附和解吸的动态平衡，吹扫时间过大，组分又会从捕集阱中解析出来，发生穿透现象。为了保证丙酮分子能够被最大程度的吹出，而又不发生穿透，在3～21 min范围考察了吹扫时间的影响。结果表明从3 min到13 min时，丙酮峰面积急剧增大；在13 min到15 min之间变化趋势平缓；吹扫时间大于15 min时，峰面积几乎没有变化，说明吹扫时间为15 min时，溶液中的丙酮已经被吹扫完全。因此，选择的最佳吹扫时间为15 min。

2.1.3脱附时间的选择脱附时间太短，捕集管内吸附的目标物不能被充分地释放出来，从而导致分析的灵敏度降低；脱附时间太长，样品分析的效率会降低。在吹扫时间为15 min前提下，分别研究了不同的脱附时间(2、4、6、8、10和12 min)，结果表明，随着脱附时间的不断延长，丙酮峰面积持续增加，在8 min后，峰面积达到最大，之后随着时间进一步增加，吹扫捕集丙酮峰面积几乎不变。为了节省分析时间，选择8 min作为丙酮脱附的最佳时间。

2.1.4烘焙时间的选择目标物被吹扫出的过程中不可避免的带有水分，捕集管在捕集目标物的同时也会吸附水分。水分残留在捕集管中会对下一次捕集目标物产生影响，因此选择合适的烘焙时间也十分重要。在设定吹扫时间为15 min，脱附时间8 min条件下，分别设定不同的烘焙时间(2、4、6、8、10 min)，在优化后的GC-MS条件下分析测定，结果表明，随着烘焙时间的不断增加，丙酮峰面积稳定增加。在6 min后峰面积达到最大，之后随着时间进一步增加，丙酮峰面积变化趋势较小，故选择6 min作为最佳烘焙时间。

综上，吹扫捕集/GC-MS测定丙酮溶液的优化条件为：色谱柱初始温度40 ℃，以速率40 ℃/min，升高到最终温度200 ℃，保持1 min。吹扫时间为15 min，丙酮脱附时间为8 min，烘焙时间为6 min。

2.2 样品处理

糖尿病病人尿液样品中由于成分复杂，尤其是有些病人存在肾功能损伤时，会导致尿液中泡沫偏多[16]。在对尿液样品吹扫捕集的过程中，气体吹扫时泡沫非常多，并沿着吹扫捕集管壁上升，进入传输线，而致使传输线的不可逆污染，极端情况下还会影响色谱柱及检测器的分离分析效率。为了克服这一缺点，尝试用201-二甲基硅油、磷酸三丁酯、羟基硅油对尿液进行消泡处理。结果表明，201-二甲基硅油、磷酸三丁酯、羟基硅油都具有一定的消泡效果，其中201-二甲基硅油消泡效果最好，对GC-MS的测定也无影响，故我们最终选择201-二甲基硅油作为本实验的消泡剂。

2.3 方法分析性能

在实际样品测定过程中，发现糖尿病病人和正常人尿液中的丙酮含量存在较大的差别，因此配制了两个不同浓度的标准系列的丙酮溶液进行实验。标准系列1浓度分别为20、40、50、80、100、200 μg/L，标准系列2浓度分别为200、400、600、800、1 000 μg/L。在最佳色谱条件下进行分析，以峰面积的平均值(Y)对丙酮浓度(X，μg/L)作线性回归，结果该方法在20～1 000 μg/L浓度范围内线性关系良好(R2>0.99)；用优化后的条件于1 d内5次重复分析浓度为100 μg/L的丙酮标准溶液，将测量得到的峰面积代入线性回归方程，得到相对标准偏差(RSD)为6.73%，采用选择离子扫描的方式，将吹扫捕集仪和GC-MS调节至最佳工作状态，然后用本方法连续11次测定浓度为20 μg/L的丙酮标准溶液，将测得的峰面积代入线性回归方程，得到检测限为13.18 μg/L。

表1 测定丙酮的线性方程、相对标准偏差(RSD)和检出限

2.4 加标回收实验

吹扫捕集进样实际上测定的是从待测溶液中被气体吹出后吸附在吸附柱上，经加热后脱附出来的化合物。人体尿液中除了含有大量的水分，还包含许多种其它化合物。因此，为了考察尿液体系的基体影响，我们对加标回收率进行分析，方法如下：取适量的正常人、血糖控制较好的糖尿病病人和血糖控制较差的糖尿病病人的尿液各3份，分别加入3种已知浓度的丙酮标准溶液，采用优化后的方法，进行加标回收实验。每个样本平行测定3次，结果列于表2。加标回收率基本在87.0%～98.0%之间，可见本方法对测定人体尿液中的丙酮具有较高的准确度。

表2 加标回收率实验结果(n=3)

2.5 实际样品的测定

采集正常人及糖尿病患者的尿液样品，用已经建立的实验方法对其进行分析，测试结果列于表3。正常人的尿液中也可以检测到低浓度的丙酮，由于丙酮是脂肪代谢的产物，正常人体尿液中也存在一定量的丙酮，但是糖尿病病人尿液中的丙酮远远高于正常人尿液中丙酮的含量。应用吹扫捕集/GC-MS的方法测定人体尿液中的丙酮，通过比较分析糖尿病病人和正常人尿液中的丙酮含量，可以对糖尿病进行早期初步诊断，这对糖尿病的病程诊断具有重要意义。

表3 正常人及糖尿病患者尿液中血糖值与丙酮含量

图1 糖尿病患者的血糖值与尿液中丙酮含量的关系Fig.1 Relationship between blood-sugar value and acetone content in urine of diabetic people

2.6 血糖浓度与尿液中丙酮含量相关性研究

采用统计分析的方法对表3中血糖浓度和尿液中丙酮含量进行了拟合，考察了糖尿病病人的血糖值和尿液中丙酮浓度的相关性，如图1所示。由表3可以计算出尿液中丙酮浓度和血糖值之间的相关系数在高度显著水平为0.998，相关性明显。尿液中丙酮含量低于1 000 μg/L可基本诊断为正常，而当尿液中丙酮的含量在1 000 μg/L到10 000 μg/L之间可基本诊断为糖尿病初、中期患者，尿液中丙酮含量高于10 000 μg/L的可基本诊断为糖尿病高危期患者。

3 结论

本文建立了吹扫捕集/GC-MS联用测定人体尿液中丙酮含量的方法，该方法具有较好的精密度和准确度，能够满足实际尿液样品中丙酮含量的测定。利用该方法测定得到的人体尿液中丙酮含量与人体血糖值显著相关，因此依据尿液中的丙酮含量，就可以初步诊断糖尿病患者的病程。此方法是一种非侵入式的测定方法，不需要采集患者的血液，操作简单，测试周期短，能够减轻患者痛苦，减少院内感染的风险，有望应用于糖尿病的诊断之中。