牛肉排酸成熟过程中的品质变化

付 丽，杨兆华，高雪琴，郝修振,*，马路石

（1.河南牧业经济学院食品工程学院，河南 郑州 450046；2.河南伊赛牛肉股份有限公司，河南 焦作 454450）

排酸过程是现代肉类卫生学及营养学所提倡的一种后成熟工艺[1]。动物屠宰后的半胴体经一定时间排酸后即可完成肉类成熟。排酸牛肉又叫冷鲜牛肉、冷却排酸牛肉，由于低温排酸且经历了较为充分的解僵、成熟过程，不仅肉质柔软有弹性、味道鲜美，而且安全营养[2-3]，其肌肉蛋白的胶凝性、黏结性和保水性等加工性能更适于肉品加工。实践证明，不经排酸的牛肉品质较差[4-6]，而且动物屠宰后胴体经排酸成熟是获得高品质肉的必需条件[7]。

从20世纪60年代开始，发达国家就开始研究和推广排酸牛肉。Olson等[8]对比研究宰后于2 ℃和25 ℃条件下贮藏的牛背最长肌、半腱肌和腰大肌肌原纤维的变化，揭示动物宰后肌肉成熟的机制；Neath等[9]比较研究水牛肉与黄牛肉宰后成熟期间肉嫩度及pH值的变化；Smith等[10]研究得出，电刺激处理可以明显改善羊驼肉的嫩度。据报道，在法国，牛肉上市之前至少要经历6～8 d的成熟[11]，欧盟牛肉市场中100%为排酸牛肉。牛肉在我国虽然是第二大肉类食品[12]，但排酸牛肉只占25%，这是由于牛胴体排酸时间长，生产效率低，是冷鲜肉生产过程中能源消耗最大的工序[13]。一般在工业生产条件下，为提高生产效率，通常把胴体放在2～4 ℃的冷库中吊挂2～3 d，使其适当成熟后即可分割，在运销过程中继续成熟，造成市场上的牛肉多数成熟不够，迫切需要开发一种安全、快速的牛肉排酸技术；另外，国内对于牛肉排酸过程中品质变化规律的系统研究，尤其是肌原纤维超微结构的研究较少，多数企业实际生产中缺乏具体的牛胴体排酸成熟操作规范，也没有相应的排酸牛肉标准，造成我国冷鲜牛肉品质参差不齐。

本研究以牛肉为研究对象，测定牛肉排酸1～7 d期间的硬度、保水性、pH值、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）、菌落总数、大肠菌群数以及肌原纤维超微结构，对牛肉排酸过程中的品质变化规律进行研究，为冷鲜牛肉实际生产提供一定的指导，并为牛胴体快速排酸技术的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛肉（西冷）来自河南伊赛牛肉股份有限公司，在屠宰完不超20 min的牛胴体上取相应部分的牛肉约2 500 g（5 cm×15 cm×60 cm），简易包装后，在0～4 ℃条件下，2 h内运送到实验室。

氯化钾、氯化钠、磷酸钾、乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氯化钙、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、标准酪蛋白及50%戊二醛（均为分析纯） 河南华丰试剂有限公司；平板计数琼脂、LST肉汤、BGLB肉汤 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1S超净工作台 苏州净化有限公司；冰温保鲜库 南京金陵鸿博环境科技发展有限公司；DHP-080电热恒温培养箱 郑州生元仪器有限公司；Scientz-04无菌均质机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Hh-S11-2-S电热恒温水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限公司；FA224电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；FSH-2A高速匀浆器 江苏省金坛市白塔新宝仪器厂；pHSJ-3F酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；CT-3质构仪 美国Brookfield公司；V-1200可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；KH20R台式高速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；JEM-1400透射电子显微镜 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

在无菌条件下，打开包装取出牛肉，用无菌的不锈钢钩挂在挂肠车上，共3 块，推入排酸冷库内吊挂排酸，温度（4±1） ℃，相对湿度80%，肉样间距10 cm。在排酸第1、2、3、4、5、6、7天时分别取肉样测定硬度、保水性、pH值、MFI、菌落总数、大肠菌群数等指标，并用透射电镜观察排酸1、3、5 d时牛肉肌原纤维超微结构的变化。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 硬度

参照刘佳东等[4]的方法，并稍做改动。取厚度为3 cm的肉样，去除肉样表面的脂肪及结缔组织，装入塑料薄膜袋，在80 ℃的水浴锅中恒温加热至肉样中心温度达75 ℃，冷却至室温；用直径1.27 cm的取样器沿肌纤维方向钻取3 cm长的肉柱，用质构仪测定硬度。采用TA7探头，TA-SBA夹具，测试模式为压缩，测试速率2 mm/s，返回速率1 mm/s，触发点负载10 g，循环2 次，目标形变50%。

1.3.2.2 保水性

保水性是评价冷鲜牛肉品质的重要指标[14-15]。汁液流失率是表征肉保水性的指标之一，其值越大说明牛肉的保水性（持水力）越差[16]。参照付丽等[17]的方法。选取红肉部分，切成5 cm×5 cm×5 cm的肉块，用滤纸吸干表面水分并准确称质量，记为吊挂前质量（m1）；将肉样用塑料袋套住，用线绳悬挂于冷库内，吊挂24 h后取出，吸干表面水分再准确称质量，记为吊挂后质量（m2）。汁液流失率按照下式计算。

1.3.2.3 pH值

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[18]及杨文婷等[13]的方法。称取4 g瘦肉样，放入40 mL 0.1 mol/L KCl溶液中，并用高速匀浆器匀浆，然后用pH计测定。

1.3.2.4 MFI

MFI是宰后牛肉排酸成熟过程中，肌原纤维的结构被破坏及蛋白质不断被降解的程度，可以反映冷却牛肉成熟的进程[19]，是衡量宰后肌肉排酸成熟速率的指标。MFI越大，说明肌原纤维内部结构受到破坏的程度越大，则肉的嫩度越佳[20]。

参照孙天利[21]、Culler[22]、Geesink[23]等的方法。除去肉样中筋腱、肌膜及脂肪组织，称取4 g放入匀浆器内，加入15 mL预冷的MFI缓冲液（含100 mmol/L氯化钾、20 mmol/L磷酸钾、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L氯化钙溶液，用HCl调节pH值至7.0），在冰浴条件下10 000 r/min匀浆3 次，每次20 s，间隔1 min；匀浆后加缓冲液至40 mL，然后进行冷冻离心（1 000×g、15 min、4 ℃）；弃上清液，用40 mL预冷的MFI缓冲液悬浮沉淀，继续冷冻离心（1 000×g、15 min、4 ℃），弃上清液；在沉淀中加入20 mL预冷的MFI缓冲液，使其充分悬浮，然后用150 目滤布过滤悬浮液，除去结缔组织；用10 mL预冷的MFI缓冲液冲洗离心管，再次过滤；准确吸取10 mL滤液于烧杯中待用。用双缩脲法测定滤液中蛋白质的质量浓度，然后用MFI缓冲液将蛋白质滤液的质量浓度调整为0.5 mg/mL，在540 nm波长处测定其吸光度，所得结果乘以200即为MFI。

1.3.2.5 菌落总数

取具有代表性的肉样，称取无菌条件下剪碎的肉样25 g，装入无菌的均质袋内，加入225 mL生理盐水，用拍打式匀浆机拍打3 min，制成1∶10（m/V）稀释液，参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[24]进行测定。

1.3.2.6 大肠菌群数

肉样处理方法同上，采用GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[25]中的MPN（most probable number）法进行测定。

1.3.2.7 肌原纤维超微结构

参照Mestre等[26]的方法，并稍作修改。采用透射电镜（transimission electron microscrope，TEM）观察排酸1、3、5 d牛肉肌原纤维超微结构的变化。

用取样刀顺肌纤维方向将肉样切成1 mm×1 mm×2 mm的小条→立即用预冷的2.5%戊二醛溶液固定4 h→用0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液（PBS）冲洗4 次，每次10 min→在通风橱内用1%锇酸固定1.5 h→PBS漂洗4 次，每次10 min→用梯度乙醇浸泡脱水2 次：50%乙醇15 min、70%乙醇15 min、80%乙醇15 min、95%乙醇15 min、100%乙醇15 min→无水丙酮浸泡脱水2 次，每次15 min→1∶1环氧树脂812和丙酮溶液浸泡渗透1.5 h→2∶1环氧树脂812和丙酮溶液浸泡渗透过夜→环氧树脂812浸泡渗透过夜→放置于硅胶板上，37 ℃条件下聚合12 h→45 ℃条件下聚合12 h→60 ℃条件下聚合24 h→半薄切片定位、超薄切片→饱和醋酸双氧铀水溶液染色20 min→水洗→烘干→柠檬酸铅溶液染色5 min→水洗→烘干→电镜观察、拍照（加速电压80 kV，放大倍率50 000）（图片由河南中医药大学电镜中心提供）。

1.4 数据处理

每个实验重复3 次，数据以平均值±标准差表示。图表采用Sigmaplot 12.5软件绘制，数据采用SPSS Statistics 20.0统计分析软件进行显著性分析，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 排酸过程中牛肉硬度的变化

动物宰杀前依靠一系列有氧代谢获取能量，宰杀放血后，正常的新陈代谢停止，肌糖原无氧酵解最终形成乳酸，乳酸会使肌球蛋白凝固，肌肉很快收缩变硬。另外，由于ATP水平下降及乳酸浓度提高（pH值下降），使得肌浆网钙泵的功能失常，失去钙泵作用，无法收回释放的Ca2＋，致使其浓度增高，引起肌动蛋白沿着肌球蛋白滑动收缩；Ca2＋促使粗丝中肌球蛋白头部的ATP酶活化，从而更加快了ATP的分解，促使肌动蛋白细丝和肌球蛋白粗丝之间交联形成肌动球蛋白，引起肌肉连续且不可逆的收缩，称为肉的僵直。达到僵直期的肌肉内将发生诸多化学反应，导致肌肉的结构及成分发生变化，使肉变软，同时肉的保水性增加，牛肉能达到最佳风味，即为肉的解僵及成熟。

图1 排酸过程中牛肉硬度的变化Fig. 1 Change in beef hardness during postmortem aging

由图1可知，排酸期间牛肉的硬度呈先上升后下降的趋势。排酸1～3 d期间，肉样硬度极显著增加（P＜0.01），由1 349 g升至2 493 g，说明屠宰后的牛肉在排酸初期逐渐进入僵直期，使肌肉硬度变大，在排酸3 d时进入最大僵直期[19-20]，这与张成龙等[2]研究得出的排酸1 d牛肉最硬的结论不太一致，这可能是牛品种不同所致；从排酸3 d开始，肉样的硬度开始极显著下降（P＜0.01），排酸7 d时降为1 844 g，这可能是由于随着排酸的进行，肉样经过最大僵直期后开始进入解僵期，肌肉组织内发生一系列生物化学变化，尤其是在组织蛋白酶的作用下，肌肉蛋白发生降解，肌原纤维小片化使肌肉保水性回升，从而使肉样的硬度降低，嫩度增加[27]，这与Braghieri等[28]研究发现7 d成熟期会明显改善牛肉嫩度的结论一致。

2.2 排酸过程中牛肉保水性的变化

图2 排酸过程中牛肉汁液流失率的变化Fig. 2 Change in beef drip loss during postmortem aging

由图2可知，随着排酸时间的延长，肉样汁液流失率呈先上升后下降的趋势。排酸1～3 d时，肉样的汁液流失率极显著增加（P＜0.01），这是由于在排酸的前3 d，肉样处于僵直状态，牛肉组织中的自由水不断外渗，导致汁液流失率不断增大，保水性逐渐变差，尤其是排酸第3天时达到最大僵直期，牛肉的保水性最差；排酸3 d后，随着排酸时间的延长，牛肉的汁液流失率开始显著下降（P＜0.05），说明牛肉进入解僵期，肌肉回软，保水性开始恢复；但排酸第7天时牛肉的保水性显著低于排酸1 d时（P＜0.05），说明宰后牛肉经过僵直后肌肉变硬，保水性下降，解僵、成熟后保水性上升，但无法恢复热鲜肉状态，这与图1的趋势相一致。

2.3 排酸过程中牛肉pH值的变化

pH值对肉色、嫩度及保水性等指标均有重要影响[29-30]。牛屠宰后，由于肌肉中糖原无氧酵解产生的乳酸和ATP分解产生的磷酸根离子使肉的pH值逐渐下降，当肌糖原无氧酵解酶被无氧酵解产生的酸和ATP降解产生的氨气所抑制而失活，使糖酵解停止，此时肉pH值达到动物宰后最低值。

图3 排酸过程中牛肉pH值的变化Fig. 3 Change in beef pH value during postmortem aging

由图3可知，牛肉在排酸过程中，pH值呈现先下降后上升的趋势。排酸前3 d时，牛肉的pH值下降极显著（P＜0.01），这是由于牛被宰杀后，牛肉组织细胞即开始进行无氧呼吸，细胞内的糖类物质经生化反应生成乳酸，刚宰杀后的牛肉细胞内有很多糖类物质，故在排酸前3 d，乳酸以持续较快的速率生成，使得牛肉的pH值下降较快；排酸1 d时，牛肉的pH值为5.78，与NY/T 2793—2015《肉的食用品质客观评价方法》[31]规定的宰后24 h时牛肉pH值介于5.50～5.90的标准一致；排酸3 d时，牛肉pH值降至最低，为5.56，这与王凯[32]研究得出的黄牛肉排酸第3天时pH值降为最低（5.6）的结果基本一致，但与刘佳东等[4]研究得出的牦牛肉排酸4 d及黄牛肉排酸5 d时pH值降至最低的结果不一致，与刘萌等[33]研究得出的牛屠宰后4 d pH值降为最低的结论也不一致，这可能是由于牛品种及牛肉部位不同；从排酸第3天开始，牛肉pH值开始显著回升（P＜0.05），原因是随着糖类物质的消耗殆尽，乳酸生成结束，开始进行生化分解，其分解速率高于生成速率，pH值开始升高，故在排酸的后4 d，pH值以较为缓慢的速率回升，在排酸第7天达到5.84，恢复到正常新鲜牛肉的pH值，说明宰后牛肉达到排酸成熟需要7 d。

2.4 排酸过程中牛肉MFI的变化

MFI是反映肌细胞内部肌原纤维及其骨架蛋白完整程度的指标。由图4可知，在牛肉排酸过程中，随着排酸时间的延长，肉样MFI显著增加（P＜0.05），说明牛肉肌原纤维内部结构完整性受到的破坏程度不断增加，牛肉的嫩度不断提高，这与刘玉青[34]、Li Ke[27]等的研究结果基本一致。排酸3～5 d时，肉样的MFI增加极显著（P＜0.01），这可能是由于肌原纤维在微生物酶和蛋白酶的作用下，结构被破坏，造成肌原纤维的小片化，且随着排酸过程的进行，小片化程度不断加深；也有可能是由于在冷藏条件下，随着时间的延长，肌原纤维粗细丝逐渐发生冷收缩以及钙离子的长时间作用，造成Z线断裂，使肉样的MFI升高。上述结果说明，排酸3 d时宰后牛肉进入解僵阶段。

2.5 排酸过程中牛肉菌落总数的变化

由图5可知，在牛肉排酸过程中，菌落总数呈现持续上升的趋势（P＜0.05）。原因可能是牛肉在4 ℃条件下排酸，虽然温度低但并不能完全抑制微生物的生长与繁殖，尤其是一些嗜冷菌在0～4 ℃条件下生长繁殖，造成了菌落总数的不断上升，当排酸7 d时菌落总数达4.82 （lg（CFU/g）），肉样为次鲜肉[35]。因此，牛肉在排酸期间一定要控制好排酸间的卫生状况。

图5 排酸过程中牛肉菌落总数的变化Fig. 5 Change in beef aerobic plate count during postmortem aging

2.6 排酸过程中牛肉大肠菌群数的变化

图6 排酸过程中牛肉大肠菌群数的变化Fig. 6 Change in beef coliform count during postmortem aging

由图6可知，牛肉在排酸过程中，大肠菌群数呈现持续上升的趋势（P＜0.05）。这可能是由于牛肉在进入排酸库之前，受到了空气中大肠菌群或牛粪的污染，其在排酸过程中不断繁殖，造成了大肠菌群数的不断上升，同样说明牛肉在排酸期间一定要控制好排酸间的卫生状况。

2.7 排酸过程中牛肉超微结构（肌原纤维）的变化

图7 排酸过程中牛肉的肌原纤维超微结构Fig. 7 Ultrastructure of beef myofibrils during postmortem aging

宰后僵直期间，肌肉肌节长度与肉的嫩度呈正相关，即肌节长度越长，肉质越嫩[36-38]。正常肌肉肌节长度为2 000～2 500 nm。由图7a可知，排酸1 d时，肌原纤维结构清晰，Z线排列较整齐，肌节长度为1 495.21 nm；排酸3 d时，Z线开始扭曲，部分已断裂，肌节长度为1 464.17 nm，最窄处只有1 402.48 nm，说明此时肌节处于收缩状态，原因可能是肌浆网释放的钙离子激活ATP酶活性，引起肌肉收缩；排酸5 d时，Z线模糊不清，肌节长度为1 718.52 nm，较宽处为1 765.84 nm，较窄处为1 649.41 nm，说明随着排酸时间的延长，肌动蛋白和肌球蛋白的僵直联结弱化，导致肌节僵直收缩复原，僵直肌节长度恢复，使肌节长度逐渐增加。

由图7b可知，在牛肉排酸1 d时，Z线、粗细丝清晰可见；排酸3 d时，Z线、粗细丝已扭曲变形，变得模糊不清，且呈点状分布，说明此时Z线已断裂且大部分被降解；排酸5 d时，Z线变得更加模糊，几乎消失，成为晕染状，几何构型发生明显变化，粗细丝依稀可见。这也从超微结构的角度证明了牛肉排酸过程中，肌原纤维小片化程度确实在不断加深。

3 结 论

活牛被宰杀后，其肌肉组织转化成适宜食用的肉要经历僵直、解僵和成熟3 个过程，即牛胴体的冷却排酸过程，也就是牛肉的成熟过程[39-40]。本研究通过对排酸过程中牛肉品质变化的研究发现，随着排酸过程的进行，牛肉的硬度和汁液流失率均先增大后减小，在排酸3 d时达到最大值；pH值则是先降低后升高，在排酸3 d时达到最低值5.56，在排酸7 d时回升到5.84，达到正常新鲜牛肉的范围；MFI、菌落总数和大肠菌群数均逐渐增大；从TEM观察肌原纤维超微结构可以发现，Z线逐渐扭曲变形直至近乎消失，证明肌原纤维确实在不断降解。

由以上研究得出结论：牛肉在0～4 ℃条件下排酸成熟需要至少7 d，排酸3 d时为最大僵直期，即前3 d是排酸的关键时期；另外，进入排酸间前最好对胴体表面进行一定的减菌处理，并且严格执行卫生操作规范，控制好屠宰间、排酸间的环境卫生，以尽量减少牛胴体表面初始菌数，从而保证排酸成熟过程中牛肉的品质。