多环芳烃分子印迹柱-高效液相色谱荧光检测法快速测定烤肉中15 种多环芳烃

阳文武，谭顺中，郭 娅,*，周 浓

（1.重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404000）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是由2 个或2 个以上苯环稠合而成的一类芳香族化合物，主要由有机物质（包括油、木材、垃圾废物和煤）的热解和不完全燃烧产生，在食品加工过程（如熏、烤、烘培、煎、炸等）中可能产生PAHs。PAHs具有“三致”（致癌、致畸和致突变）毒性，属于持久性有机污染物[1-3]。欧盟委员会835/2011号文件《Amending regulation（EC） No 1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in foodstuffs》规定，熏、烧、烤肉制品中苯并（a）芘的限量为2 μg/kg（欧盟委员会No1881/2006号文件《Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs》规定限量为5 μg/kg），且PAH4（䓛、苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（a）芘）的总量不大于12 μg/kg（欧盟委员会No1881/2006号文件规定总量不大于30 μg/kg），而我国GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中仅对PAHs中的苯并（a）芘规定了限量为5 μg/kg（GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中也为5 μg/kg），暂未对其他PAHs规定限量值。鉴于烤肉在日常生活中的重要性，对烤肉中PAHs的含量水平进行监测对确保烤肉安全具有十分重要的意义。

目前，关于PAHs污染情况的文献报道集中在水[4-6]、大气[7-9]、土壤[10-12]及食用油[13-15]等方面，对烤肉中PAHs的污染状况却鲜有报道。检测PAHs的方法主要有高效液相色谱-荧光检测（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）法[16-18]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[19-21]、高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[22-24]等，大部分已有报道多采用索氏提取法[25-27]、超声波提取法[28-30]等。索氏提取法整个过程耗时长，有机溶剂用量大，不适合实验室大批量的检验工作，本研究用少量乙腈超声提取后，采用多环芳烃分子印迹柱（molecular imprinting column of PAHs，MIP-PAHs）净化，净化后的样品进行HPLC-FLD检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烤鸭（15 批次）、烤鸡肉（2 批次）、烤肉（2 批次）、烤羊肉（2 批次）、烤牛肉（3 批次）样品购自重庆市东北片区（包括万州区、梁平区、忠县、开州区、云阳县、奉节县、巫山县、巫溪县及城口县）不同摊位。

乙腈、正己烷、二氯甲烷（均为色谱纯） 北京迪马科技有限公司；15 种PAHs混合标准溶液 北京曼哈格生物科技有限公司；苊、芴、芘、菲、蒽、萘、荧蒽、苯并（a）蒽、苯并（a）芘、二苯并（a,h）蒽、苯并（b）荧蒽、茚并（1,2,3-c,d）芘、苯并（k）荧蒽、苯并（g,h,i）苝、䓛标准溶液 美国ChemService公司；MIP-PAHs 德国CNW公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（配备荧光检测器）美国安捷伦科技有限公司；KH-2000DB超声波清洗器昆山禾创超声仪器有限公司；摩尔基因型1850C超纯水机上海摩勒科学仪器有限公司；IKA MS3涡旋振荡器德国IKA公司；Waters固相萃取装置 美国Waters公司；Sartorius SQP分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；BiotageTurboVap2氮吹仪 瑞典Biotage公司；4-16S离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

单标溶液配制：分别准确量取各种单标溶液适量，用乙腈稀释成质量浓度为10 ng/mL的单标溶液。

PAHs标准中间液配制：准确移取0.1 mL PAHs混合标准溶液（15 种PAHs的质量浓度均为200 μg/mL）于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，得质量浓度为200 ng/mL的标准中间液，4 ℃保存，有效期为3 个月。

PAHs标准工作液配制：分别准确移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50 mL PAHs标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成质量浓度分别为1、5、10、20、50 ng/mL的系列标准工作液。

1.3.2 样品前处理

样品提取：称取2 g（精确到0.000 1 g）试样于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋振荡30 s后，超声提取30 min，4 500 r/min离心5 min；吸取上清液于氮吹管中，下层用10 mL乙腈重复提取1 次，合并提取液于氮吹管中，35 ℃氮吹至近干；加入5 mL正己烷，涡旋振荡30 s溶解，待净化。

样品净化：依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化MIP-PAHs固相萃取柱，将待净化溶液全部上样，用2 mL正己烷洗涤氮吹管并入柱中，用正己烷淋洗2 次，每次3 mL，弃去淋洗液，再用10 mL二氯甲烷洗脱并收集净化液至离心管；35 ℃氮吹至近干，用乙腈定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：Waters PAHs C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈和水；柱温35 ℃；流速1.2 mL/min；进样量10 μL；对流动相梯度洗脱程序进行优化。

1.3.4 方法的线性范围、检出限及定量限测定

在优化所得测定条件下，对配制的标准工作液进行测定，以待测PAHs的峰面积（y）为纵坐标，各PAHs的质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。在空白基质中依次加入较低质量浓度的标准溶液后进行测定，以3 倍信噪比（RS/N=3）和10 倍信噪比（RS/N=10）分别确定方法的检出限和定量限。

1.3.5 方法的回收率和精密度测定

称取2 g（精确到0.000 1 g）空白试样，分别进行5.0、10.0、25.0 μg/kg 3 个加标水平的基质加标回收实验，按照1.3.2节进行样品前处理，并进行HPLC-FLD分析，计算平均回收率和方法精密度（相对标准偏差（relative standard deviation，RSD））。每个添加水平均平行测定6 次。

2 结果与分析

2.1 样品净化方式的选择

称取空白样品，按照10.0 μg/kg的添加水平进行加标回收实验，比较MIP-PAHs和以900 mg硫酸镁、100 mg N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、100 mg C18为填料的净化管2 种净化方式对烤肉样品的净化效果。

表1 2 种净化方式回收率的比较Table 1 Comparison of recovery rates of two purification methods

由表1可知，MIP-PAHs和以900 mg硫酸镁、100 mg PSA、100 mg C18为填料的净化管净化的回收率分别为80.6%～95.8%和60.7%～75.7%，MIP-PAHs固相萃取柱的分析结果优于以900 mg硫酸镁、100 mg PSA、100 mg C18为填料的净化管，因此选择MIP-PAHs净化。

2.2 色谱条件的优化

流速和流动相的不同配比直接影响PAHs的出峰时间及分离效果，考察表2～3中的2 种仪器条件对PAHs分离效果的影响。由图1可知，以表3中的参数作为仪器条件时，标准溶液色谱图的基线不平，以表2中的参数作为仪器条件时，标准溶液色谱图的基线平稳，且空白加标样品可以实现较好地分离。

表2 流动相洗脱梯度、流速及荧光检测器梯度（1）Table 2 Mobile phase gradient program, fl ow rate and fl uorescence detection gradient (1)

表3 流动相洗脱梯度、流速及荧光检测器梯度（2）Table 3 Mobile phase gradient program, fl ow rate and fl uorescence detection gradient (2)

图1 不同色谱条件下标准溶液和空白加标样品的色谱图Fig. 1 Chromatogram of standard solution and spiked blank sample under different chromatographic conditions

2.3 方法的线性范围、检出限及定量限

表4 方法的线性范围、检出限及定量限Table 4 Linear ranges, LODs and LOQs of the method

由表4可知，用HPLC-FLD法测定时，PAHs在质量浓度1～50 ng/mL线性范围内均呈良好的线性关系，r＞0.999 5，方法检测限为0.33～3.30 μg/kg，定量限为1.0～10.0 μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

表5 方法回收率和RSDs（n=6）Table 5 Recovery and precision (RSDs) of the method (n= 6)

由表5可知，HPLC-FLD法中各PAHs在5.0、10.0、25.0 μg/kg 3 个加标水平的回收率分别为71.1%～90.5%、80.6%～96.8%及83.0%～98.8%，RSD分别为1.8%～5.8%、1.5%～4.7%及1.0%～3.6%，表明方法准确度和精密度均满足分析要求。

表6 样品PAHs含量测定结果Table 6 PAHs contents of real samples

2.5 实际样品测定

按照1.3.2节处理样品，将处理好的样品在优化所得条件下进行测定，外标法定量。

由表6可知：15 种PAHs在24 份烤肉样品中均有检出，其中烤鸡肉2和烤肉1中苯并（a）芘含量大于5.0 μg/kg；烤鸭13、烤肉2和烤羊肉1中苯并（a）芘含量大于2.0 μg/kg，且PAH4（䓛、苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（a）芘）总量均大于12.0 μg/kg；烤鸡肉1和烤牛肉2中苯并（a）芘含量小于2.0 μg/kg，但PAH4总量均大于12.0 μg/kg；24 份烤肉样品中有2 份不符合我国标准，7 份不符合欧盟标准。由此可见，单一控制苯并（a）芘的含量不足以保证烤肉的质量，为提高其安全性，且与国际接轨，应尽快提高我国熏、烧、烤肉制品中PAHs的限量标准。

3 结 论

比较MIP-PAHs和以900 mg硫酸镁、100 mg PSA、100 mg C18为填料的净化管2 种净化方式对烤肉样品的净化效果，结果表明：采用MIP-PAHs净化时，空白样品加标回收率高，且能减少其他物质对目标物的干扰。流速和流动相的不同配比直接影响PAHs的出峰时间及分离效果。在进行预实验时，参照GB 5009.265—2016《食品安全国家标准 食品中多环芳烃的测定》中的色谱条件，但标准溶液中的15 种PAHs目标物分离不理想，且基线不平，最终通过不断摸索确定了本研究中的色谱条件。

本研究用少量乙腈超声提取样品后，采用MIP-PAHs净化，净化后的样品进行HPLC-FLD检测。结果表明，烤肉中15 种PAHs的加标回收率为71.1%～98.8%，RSD为1.0%～5.8%，该方法高效、快速、灵敏度高，可以用于烤肉中15 种PAHs的定量分析。