蛋白质多肽酶解及分离新技术的改进

刘宝阳，张 磊，范志娟，田亚琼，刘树业△

(1.天津市宝坻区人民医院检验科/天津医科大学宝坻临床学院，天津 301800； 2.天津市第三中心医院检验科 300170)

蛋白质组是指“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”[1]。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，分析细胞内的蛋白质组成成分和表达水平，进一步认识生命活动规律。蛋白质组学分析不仅仅是一种方法学，而是各种分离技术、鉴定技术、生物信息学技术的有机整合。因此如何提高分离技术，是进行蛋白质组学研究的重要环节。本研究将Self-owned胰蛋白酶、强阳离子交换与反相C18二维一体毛细管色谱柱联合用于蛋白质组学技术中，旨在探讨其在蛋白质组分析和表达方面的优势，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 选择不同浓度的牛血清清蛋白(BSA)，分为高浓度(6.5 μg/mL)、中浓度(6.5×10-3μg/mL)、低浓度(6.5×10-6μg/mL)及极低浓度(6.5×10-8μg/mL)。

1.2实验仪器 纳升级高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；LTQ-Orbitrap XL质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；强阳离子交换与C18反相二维一体毛细管色谱柱(北京谱之源公司)。

1.3方法 分别用Promega和自主修饰的Self-owned的胰蛋白酶酶解不同浓度的BSA，观察其不同胰蛋白酶的酶解效能。采用强阳离子交换与反相C18二维一体毛细管色谱柱，将不同分离模式的色谱柱以串联方式合并于同一色谱柱中，即在同一色谱柱的前部分填装强阳离子色谱材料，后部分填装C18反相液相色谱材料。将所制备的二维一体毛细管色谱柱用于分离标准BSA提取液的分离分析，并以峰容量、BSA鉴定的覆盖率及信号强度作为特征参数，观察其色谱柱的性能差异，评价二维一体毛细管色谱柱的柱能。

2 结 果

2.1Self-owned自主修饰胰蛋白酶的性能

2.1.1高活性 经过修饰的高活性、稳定的分子，无自催化作用，减少自水解产生多余肽段。4种不同型号的胰蛋白酶(tryp_auto为国产任一品牌，Pro_10为美国Promega公司生产，HLS_10及HLS_5均为自修饰)无论从蛋白鉴定种类及不同胰酶间鉴定结果相互覆盖的角度，自主修饰的胰蛋白酶酶解效能均好于其他种类胰酶。见图1。

2.1.2不自残 经L-1(对-甲苯磺酰)苯丙胺酰氯甲酮(TPCK)处理，灭活了残留的胰凝乳蛋白酶活性。

2.1.3高纯度 经多次色谱系统纯化纯度达到最优，其自主修饰Self-owned的胰蛋白酶的杂峰远少于Promega胰蛋白酶。

2.2nanoHPLC-MS技术平台 利用1D分离技术获取由自主修饰Self-owned与Promega胰蛋白酶酶解不同浓度BSA的总离子流图(TIC)。高、中浓度BSA经酶解后的TIC，其两种酶效能持平，具有较好的重复性；在低浓度的BSA中发现自主修饰Self-owned胰蛋白酶的检出信号要优于Promega胰蛋白酶。

图1 不同种类胰蛋白酶酶解效能统计图

2.3鉴定不同浓度BSA的覆盖率 利用Proteome Discoverer软件分析经胰蛋白酶酶解后不同浓度BSA的覆盖率，其经自主修饰Self-owned胰蛋白酶酶解的BSA的覆盖率略高于Promega胰蛋白酶。见表1。

表1 不同浓度BSA的覆盖率(%)

2.4不同胰蛋白酶酶解不同浓度BSA的覆盖率 用二维一体毛细管色谱柱将不同胰蛋白酶酶解不同浓度BSA酶切液进行分离，即在完全相同的实验条件下，实验结果表明将自主修饰Self-owned胰蛋白酶与二维一体毛细管色谱柱整合后，其分离效果更好，具有较高的灵敏度，特别是在上样量极低的情况下。见表2。

表2 不同胰蛋白酶酶解不同浓度BSA的覆盖率(%)

表3 二维一体毛细管色谱柱的重复性

2.5二维一体毛细管色谱柱的重复性 分别依照完全相同的分离条件，分析经自主修饰Self-owned胰蛋白酶酶解的BSA酶切液，重复做两次，选取BSA酶切的肽段混合物中相应强度较高的质荷比(m/z)740.4为特征肽段，分别记录其保留时间(RT)及信号强度(AH)，作为考察色谱柱重复性的指标，结果显示所制备的二维一体毛细管色谱柱具有良好的重复性。见表3。

3 讨 论

蛋白质组研究的关键技术包括蛋白质分离、鉴定及蛋白质数据库匹配。传统的蛋白质组研究方法是将二维凝胶电泳技术和质谱技术联合起来[2-3]。其中蛋白质分离技术包括双向电泳和色谱技术，双向电泳操作简便、快速但也存在诸多缺点，例如拷贝数较低的蛋白质不容易检测、过大或过小的蛋白质分子不容易分离和手工操作不稳定等[4]。由于双向电泳技术存在的缺陷，科研中需要升级和探索更好的蛋白质分离和鉴定技术。因此越来越多的高效分离技术，如高效液相色谱和毛细管电泳等应用于蛋白质组学研究中[5]。

胰蛋白酶作为蛋白质组学研究的一部分，其高效和完整的蛋白水解在蛋白质组研究中非常重要[6]。胰蛋白酶主要由猪或牛胰脏中获取，但胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均从胰脏制备，通常不容易完全分开，专一性不好。但经对甲苯磺酰氯甲烷(TCPK)修饰后的胰蛋白酶，可以抑制残留的胰凝乳蛋白酶活性提高纯度[7]。本研究所用的Self-owned胰蛋白酶灭活了残留的胰凝乳蛋白酶活性，减少自消化，提高了酶的纯度和催化活性，其充分的酶解更有利于分离技术的提高。蛋白质组学研究的关键技术之一就是高效分离，这也是蛋白质组学研究中需要继续追寻的目标[8]。基于液相色谱-质谱联用的蛋白质组研究分析方法中，大多采用的是毛细管液相色谱分离系统，为此目前研究的关键技术就在于毛细管色谱柱的选择和制备[9-10]。本研究中自制的二维一体毛细管色谱柱，可以消除键合缺陷造成的样品污染并具有超高分辨率和重复性，目的是有效提高蛋白质组鉴定覆盖率和蛋白质鉴定序列覆盖率。结果表明自制二维一体毛细管色谱柱，具有较高的稳定性和重复性，可以高效分离。

蛋白质组学的研究需要高效分离、高灵敏度、高通量和动态范围宽的分析技术平台。本研究首先利用Self-owned胰蛋白酶酶解BSA，结果证明其酶解效能良好，再利用自制二维一体毛细管色谱柱分离BSA观察柱效，经过比较结果表明自制二维一体毛细管色谱柱具有超高分辨率和重复性。

综上所述，将Self-owned胰蛋白酶和自制二维一体毛细管色谱柱联合用于蛋白质组学技术中，可以显著增加蛋白质数量的检出率，有助于蛋白质组学的研究，利于大规模高通量蛋白质分析和鉴定。