盐酸左旋咪唑对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

林燕飞，张 琴，高芳芳*

（1. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510000；2. 西安碑林药业股份有限公司，陕西 西安 710048；3. 延安大学附属医院，陕西 延安 716000）

近年我国恶性肿瘤发病人数逐年增加，化疗仍是目前治疗恶性肿瘤的主要手段。化疗会导致绝大多数患者免疫功能受损，诱发严重感染等并发症[1-2]。所以开发免疫功能增强药物具有重要意义。盐酸左旋咪唑除了常作为驱虫药使用外，还具有免疫调节作用，可有效改善患者免疫功能[3-4]。本研究采用经典化疗药物环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠模型，观察不同剂量盐酸左旋咪唑对模型小鼠免疫功能的影响，现将结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器

UV-8000型双光束触屏紫外可见分光光度计（上海元析仪器公司）；CTK132C型离心机（湖南湘仪离心机仪器公司）；ME1002TE型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 药品与试剂

注射用环磷酰胺（德国Baxter Oncology GmbH，批号：20170325）；胸腺肽肠溶片（黑龙江迪龙制药，批号：20170314）；盐酸左旋咪唑（山东仁和堂药业，批号：20170216）；二硝基氯苯、丙酮（国药集团）；血清IgG酶联免疫吸附测定试剂盒（上海生工）。

1.3 实验动物与饲养条件

昆明种小鼠，雄性，体重15～20 g，购自中国科学院斯莱克实验动物中心（合格证号：SCXK京2011-0012），购回后适应性饲养2周后再用于实验；维持动物房温度22～25 ℃，湿度55%～65%，12 h/12 h光暗周期，自由饮食。

2 方法

2.1 动物分组、造模与给药

昆明种小鼠随机分为6组：空白组，模型组，胸腺肽10 mg/kg对照组，盐酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg 3个剂量组，每组15只。各给药组灌胃给予相应的药物溶液10 ml/kg，每天1次，连续15 d。空白组和模型组给予等容积的生理盐水。从给药的第5天开始，除空白组外，其余5组均皮下注射环磷酰胺 40 mg/kg，每隔3 d注射1次，以制备免疫功能低下小鼠模型。

2.1.1 血清IgG含量测定及胸腺和脾脏指数计算 末次给药后24 h，球后静脉采血，3000 r/min离心15 min，分离血清。采用酶联免疫吸附实验测定血清IgG含量。然后颈椎脱臼法处死实验小鼠，称量胸腺和脾脏湿质量，计算脏器指数。胸腺指数=胸腺湿重/体质量，脾脏指数=脾脏湿重/体质量。

2.1.2 单核巨噬细胞吞噬能力检测 采用碳粒廓清实验检测小鼠单核巨噬细胞吞噬能力，具体操作如下：末次给药后24 h，按0.1 ml/10 g的量注射印度墨汁，分别于注射后2，12 min时取眼眶血20 μl，加入0.1%碳酸钠溶液20 μl，摇匀后静置10 min，测定680 nm处的光密度（OD）值。颈椎脱臼法处死实验小鼠，称量体质量、肝脾质量。吞噬指数（K）=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），吞噬系数（α）=K×1/3×体质量/肝脾质量。

2.2 二硝基氯苯所致迟发型超敏反应实验

分组、造模与给药方法同2.1。末次给药后24 h，小鼠颈部去毛，次日于去毛处涂抹50%二硝基氯苯丙酮溶液2 ml。次日，腹部皮肤再次涂抹50%二硝基氯苯丙酮溶液2 ml，激发。次日，尾静脉注射1%伊文士蓝，30 min后颈椎脱臼法处死，剥离腹部蓝色皮肤，剪碎，用4 ml丙酮和生理盐水（1:1）混合溶液浸泡24 h，离心取上清，测定610 nm处的OD值。

2.3 鸡红细胞血清溶血素实验

分组、造模与给药方法同2.1项。从给药的第5天开始，除空白组外，其余5组均腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.2 ml。末次给药后24 h，取股动脉血，3000 r/min离心15 min，分离血清。生理盐水稀释100倍后，取稀释血清1 ml与5%鸡红细胞悬液0.5 ml混合，再加入10%豚鼠血清0.5 ml。37 ℃孵育30 min，0 ℃终止反应，离心取上清，测定540 nm处的OD值。

2.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计学软件，所有计量数据用（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组内比较采用LSD-t分析。计数数据以百分比表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠血清IgG含量、胸腺和脾脏指数及单核巨噬细胞吞噬能力比较

与空白组比较，模型组血清IgG含量、胸腺和脾脏指数及K值和α值均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，胸腺肽组及盐酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg组血清IgG含量、胸腺和脾脏指数及K值和α值均明显提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。盐酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg组组间血清IgG含量、胸腺和脾脏指数及K值和α值差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。

表1 各组小鼠血清IgG含量及胸腺和脾脏指数比较（±s，n=15）

表1 各组小鼠血清IgG含量及胸腺和脾脏指数比较（±s，n=15）

注：*P＜0.05 vs 空白组；#P＜0.05 vs 模型组；ΔP＜0.05 vs 盐酸左旋咪唑15 mg/kg组；‡P＜0.05 vs 盐酸左旋咪唑5 mg/kg组

组别 剂量/mg·kg-1 IgG/μg·ml-1 胸腺指数/g·kg-1 脾脏指数/g·kg-1 K值 α值空白组 – 2.21±0.09 3.45±1.03 5.77±1.33 0.061±0.032 6.143±1.109模型组 10 1.44±0.13* 1.31±0.94* 2.14±0.98* 0.021±0.009* 4.431±0.563*胸腺肽组 10 2.00±0.10# 2.90±0.95# 4.87±1.21# 0.049±0.020# 5.976±0.994#1.68±0.08#Δ 2.17±0.84#Δ 3.89±1.15#Δ 0.030±0.014#Δ 4.447±0.067#Δ 10 1.84±0.12#Δ 2.78±0.91#Δ‡ 4.32±1.27#Δ‡ 0.041±0.017#Δ‡ 5.107±0.908#Δ‡15 2.10±0.09# 3.12±1.00# 5.12±1.30# 0.052±0.024# 6.009±1.001#5盐酸左旋咪唑组

3.2 各组小鼠迟发型超敏反应OD值和血清溶血素OD值比较

与空白组比较，模型组迟发型超敏反应OD值和血清溶血素OD值均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，胸腺肽组及盐酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg组迟发型超敏反应OD值和血清溶血素OD值均明显提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。盐酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg组组间迟发型超敏反应OD值和血清溶血素OD值差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表2。

4 讨论

免疫功能受损是恶性肿瘤化疗的常见不良反应之一，临床主要表现为食欲减退、身体疲乏、精神萎靡，检查可发现白细胞和血小板水平降低，巨噬细胞、自然杀伤细胞活性降低等[5-6]。免疫功能受损可能加速癌细胞扩散或引起严重感染等发生，不利于患者的治疗。所以开发免疫功能增强药物具有重要意义。本研究采用经典化疗药物环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠模型，观察不同剂量盐酸左旋咪唑对模型小鼠免疫功能的影响。结果显示：与空白组比较，模型组小鼠血清IgG含量、胸腺和脾脏指数、K值和α值、迟发型超敏反应OD值和血清溶血素OD值均显著降低。这也证实了化疗药物环磷酰胺可导致小鼠免疫功能低下。

表2 各组小鼠迟发型超敏反应和血清溶血素比较（±s，n=15）

表2 各组小鼠迟发型超敏反应和血清溶血素比较（±s，n=15）

注：*P＜0.05 vs 空白组；#P＜0.05 vs 模型组；ΔP＜0.05 vs盐酸左旋咪唑15 mg/kg组；‡P＜0.05 vs 盐酸左旋咪唑5 mg/kg组

5 0.400±0.117#Δ 0.431±0.120#Δ 10 0.487±0.139#Δ‡ 0.519±0.149#Δ‡15 0.521±0.154# 0.599±0.165#/mg·kg-1迟发型超敏反应实验OD值组别 剂量 血清溶血素OD值空白组 – 0.534±0.167 0.614±0.171模型组 10 0.209±0.087* 0.223±0.094*胸腺肽组 10 0.508±0.146# 0.547±0.143#盐酸左旋咪唑组

血清IgG 是血清主要的抗体成分，约占血清Ig总量的75%，具有抗菌、抗病毒作用[7]。由于IgG结合补体、增强免疫细胞吞噬功能等发面的作用优于其他免疫球蛋白，所以血清IgG含量是反映体液免疫的重要指标[8]。胸腺、脾脏是机体主要免疫器官，是免疫反应的主要场所，所以测定胸腺和脾脏指数能反映免疫功能[9]。本研究结果显示：与模型组比较，阳性对照组及低、中、高剂量组血清IgG含量、胸腺和脾脏指数均明显提高，且低、中、高剂量组上述各指标比较差异均有统计学意义。提示盐酸左旋咪唑可提高环磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下，且其效果呈剂量依赖性。

巨噬细胞是结缔组织中的固有细胞，能吞噬和杀灭外界的病原微生物，也能处理自身损伤和衰老的细胞，能有效杀灭肿瘤细胞，其活性直接影响机体免疫应答的强弱程度[10-11]。所以增强吞噬细胞的吞噬能力可有效提高免疫功能。本研究采用碳粒廓清实验检测小鼠单核巨噬细胞吞噬能力，将印度墨汁自尾静脉注射，经血液循环带至脾脏等处，根据血液中碳粒浓度计算K值和α值。本研究结果显示：与模型组比较，阳性对照组以及低、中、高剂量组K值和α值均明显提高，且低、中、高剂量组比较差异均有统计学意义。提示盐酸左旋咪唑可呈剂量依赖性提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力。

迟发型超敏反应是T细胞依赖性反应，其机制是已经致敏的机体（本研究使用50%二硝基氯苯丙酮溶液），再次在抗原的攻击下可出现迟发型炎症反应，并通过分光光度计测定迟发型超敏反应OD值判断迟发型炎症反应的程度[12-13]。免疫溶血实验的主要机制是，鸡红细胞致敏小鼠血清中存在IgM，所以致敏小鼠血清再次与鸡红细胞在体外孵育，并在补体（本研究使用豚鼠血清）的参与下发生溶血反应，通过分光光度计测定溶血程度可反映抗体溶血素的水平[14-15]。本研究的结果显示：与模型组比较，阳性对照组及低、中、高剂量组迟发型超敏反应OD值和血清溶血素OD值均明显提高，且低、中、高剂量组上述各指标比较差异均有统计学意义。提示盐酸左旋咪唑可呈剂量依赖性提高小鼠体液免疫和细胞免疫功能。

综上，盐酸左旋咪唑呈剂量依赖性提高环磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下，提示其或可治疗肿瘤化疗或其他疾病导致的免疫功能低下，尚需做进一步研究，全面评价。