鸡蛋中环丙沙星、恩诺沙星残留物HPLC-MS/MS分析

唐韵熙，白亚敏，马雪丰，毛 庆

（重庆市食品药品检验检测研究院, 重庆 401121）

喹诺酮类药物（quinolone）是一类较新的广谱抗菌药，由于其抗菌力强、口服吸收好，与其他抗菌药物无交叉耐药性，已经成为治疗细菌感染性疾病的主要药物[1]。喹诺酮类药物按其发明先后和抗菌性能的不同，可分为一、二、三、四代，环丙沙星和恩诺沙星均属于第三代，即在喹诺酮分子的C6位置上引进了氟原子，也称为氟喹诺酮[1-2]。虽然该类药物对革兰阳性菌和革兰阴性菌都有较好的抗菌作用，但也存在严重持久性的不良反应，包括肌腱损伤、中枢神经系统紊乱等[3]，也可致癌、致突变、产生过敏反应[4]。随着我国养殖业的迅速发展，兽药滥用的情况屡见不鲜，虽然中华人民共和国农业部公告第235号中明确规定，产蛋鸡禁用环丙沙星、恩诺沙星[5]，但养殖户为了提高动物产品产量，将药物用于饲料添加，或治疗家禽疾病，导致了兽药的残留，长期使用该超标食品，必定会给人体健康造成伤害。

近期，重庆、江西、海南等多地鸡蛋被检出违禁兽药残留，其中环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考检出率最多，为了保证人们的健康需求，提高兽药检测手段已刻不容缓，目前喹诺酮类药物的检测方法主要有酶联免疫法[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7-8]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLCMS/MS）[9-11]、毛细管电泳法[12]等，相比之下，高效液相与质谱相结合，通过提供精确的母离子和碎片离子的质量数，推算出可能的化合物分子式，从而对化合物结构和裂解规律做进一步确证，这不仅提高了喹诺酮类药物残留筛查的可靠性，也提高了方法的灵敏度[13]。

本文以鸡蛋为基质，通过酸化乙腈进行前处理，采用HPLC-MS/MS检测鸡蛋中的兽药残留物──恩诺沙星、环丙沙星，不仅提高了检测的检出限，且对市场上兽药残留的监管起到一定的积极作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB SCIEX API4000+三重四级杆质谱仪（美国AB Sciex公司）；LC-30A型高效液相色谱仪（日本岛津）；3-30KS型冷冻离心机（德国Sigma公司）；ML-886涡旋仪（江苏海门其林贝尔仪器制造公司）；Turbovap LV全自动浓缩仪（英国 Biotage公司）；IKA T10匀浆机（德国IKA公司）；Milli-q reference 型纯水机（美国 Millipore公司）；十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

盐酸环丙沙星对照品（中国食品药品检定研究院，批号 130451-201203）；恩诺沙星对照品（Sigma公司，批号SZBA336XV）；乙腈（美国Fisher公司，色谱纯）；甲酸（上海安谱）；正己烷（美国Honeywell公司，色谱纯）；实验用水为自制Milli-q 超纯水。

2 方法与结果

2.1 仪器条件

2.1.1 HPLC条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；进样量：1 μl；柱温：40 ℃；流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱程序：0～1.5 min，10%B～40%B，1.5～1.6 min，40%B，1.6～3.6 min，40%B～90%B，3.6～5 min，90%B，5～5.1 min，90%B～10%B，5.1～8 min，10%B，流速为0.3 ml/min。

2.1.2 MS条件 ESI正离子模式；离子源电压：5500 V；气帘气流量：25 psi；离子源温度：500 ℃；辅助加热气（氮气）流量：55 psi；雾化气流量：55 psi；采集数据方式：多反应监测（MRM）。其他质谱条件见表1。

表1 环丙沙星、恩诺沙星LC-MS/MS MRM参数

2.2 溶液的配制

2.2.1 单一对照品储备液的制备 分别准确称取盐酸环丙沙星对照品11.53 mg、恩诺沙星标准品10.88 mg，用乙腈定容至10 ml,使其浓度分别为1.039 mg/ml、1.077 mg/ml，将配置好的储备液置于4 ℃冰箱中冷藏。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密准确移取0.25 ml环丙沙星对照品储备液、0.10 ml恩诺沙星对照品储备液，置入10 ml量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成环丙沙星浓度25.97 μg/ml、恩诺沙星浓度10.77 μg/ml混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱中冷藏。使用时根据需要配制成相应浓度的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取混合均匀的蛋清蛋黄混合物5 g，于50 ml聚丙烯离心管中，加入20 ml 2%甲酸乙腈溶液，用匀浆机均质1 min，9000 r/min离心10 min。取上清于40 ℃下氮气吹干，加入1.0 ml 0.1%甲酸水溶液溶解残渣，再用2 ml乙腈饱和的正己烷去除脂肪，直至下层溶液澄清为止。下层水相过0.22 μm滤膜，取滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性供试品溶液的制备 取经过确证不含恩诺沙星和环丙沙星的混合均匀的蛋清蛋黄混合物5 g，按2.2.3供试品溶液的制备方法，制得阴性供试品溶液。

阴性供试品溶液、环丙沙星和恩诺沙星对照品溶液与供试品溶液的总离子流对比图见图1。

图1 阴性供试品溶液、环丙沙星和恩诺沙星对照品溶液与供试品溶液的总离子流图

2.3 方法学考察

2.3.1 定量限及线性关系试验 用阴性供试品溶液将2.2.2中环丙沙星、恩诺沙星混合标准工作溶液配制成系列浓度的标准溶液。在阴性供试品溶液中添加适当浓度的环丙沙星、恩诺沙星标准溶液，使得样品处理后仪器信噪比（S/N）≥10，从而确定仪器定量限；以目标物的质量浓度为横坐标（X，ng/ml），目标物分子离子峰的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到的线性关系良好，见表2。

表2 线性关系、相关系数、仪器定量限

2.3.2 回收率试验 在未检出环丙沙星和恩诺沙星的鸡蛋样品中分别添加环丙沙星含量1.0388，2.597 μg/kg，恩诺沙星含量0.4308，1.07μg/kg的混合对照品溶液，按本方法测定，计算回收率及相对标准偏差（RSD）。结果环丙沙星和恩诺沙星的回收率分别为90.7%～107.6%和80.1%～101.6%、85.0%～105.4%和86.9%～103.6%，RSD分别为6.0%，10.1%和8.7%，8.5%。

2.4 样品测定

利用本文建立的分析方法，对市场上近100批鸡蛋进行了测定。其中有6批为阳性样品，环丙沙星的检出含量为10.68～63 μg/kg，恩诺沙星的检出含量为2.36～7.13 μg/kg。

3 讨论

3.1 前处理方法的选择

喹诺酮属于高极性化合物，可溶于极性有机溶剂，而不溶于非极性溶剂，常采用的提取溶剂有乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮、酸碱性水溶液等，由于鸡蛋中含较多的蛋白质和脂肪，在提取样品时考虑采用酸化乙腈为溶剂除蛋白，采用正己烷对提取液脱脂。有研究表明，酸化乙腈对喹诺酮的提取率有提高作用[14]。

3.2 液相色谱条件的优化

选用Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱，以0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水为流动相，通过调节有机相与水相的比例，从而优化色谱条件；在流动相中加入甲酸也可在一定程度上提高检测的灵敏度及待测物的离子化效率。

3.3 质谱条件的优化

3.3.1 定量、定性离子的选择 在ESI正离子模式下对环丙沙星和恩诺沙星结构进行电离，针泵连续进样，对环丙沙星和恩诺沙星混合对照品溶液（50 ng/ml）进行一级质谱扫描，确定其母离子。再对确定的母离子进行二级质谱扫描，通过优化去簇电压和碰撞能而使其子离子有较强的离子强度，经优化后的环丙沙星和恩诺沙星质谱参数见表1。

3.3.2 环丙沙星和恩诺沙星的子离子产生途径 在正离子模式下，环丙沙星和恩诺沙星易分别形成分子离子峰[M+H]+m/z332.2和m/z360.3，两个分子离子峰易失去CO2后产生碎片离子m/z288.2和m/z316.3，m/z288.2和m/z316.3再经过两次四元环氢重排后得到m/z245.1和m/z245.3[14]。

4 结论

本文建立了用于检测鸡蛋中环丙沙星和恩诺沙星残留量的HPLC-MS/MS方法。该方法前处理过程较为简单，通过色谱及质谱条件的优化，提高了方法的灵敏度，同时，在试验线性范围内，线性关系、回收率较好，分析时间短，为环丙沙星、恩诺沙星残留的快速检测提供了可靠方法。