低血糖应激大鼠血清FT3、FT4、TT4、TSH水平及垂体组织TSHβ mRNA表达的动态变化

张博，韩闻卿，李莹，2，杨歌，赵蕾，杜信，姜雅秋

（1. 中国医科大学附属第一医院内分泌科，中国医科大学内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳 110001；2. 辽阳市中心医院神经内科，辽宁 辽阳 111000）

葡萄糖是机体组织细胞的主要能量来源和基本代谢底物。机体通过复杂的神经内分泌调节机制将血糖保持在一个恒定的水平。低血糖作为一种急性代谢应激，可诱导多种神经内分泌反应，包括刺激交感神经肾上腺系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴以及抑制促性腺轴［1］。以往的研究已经证实了低血糖可以导致血清泌乳素［2］、皮质醇和促肾上腺皮质激素浓度增加，黄体生成素和促性腺激素释放激素浓度下降［3］，但低血糖应激对下丘脑-垂体-甲状腺 （hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT） 轴分泌活动的影响被人们忽视。本研究的目的是通过建立低血糖大鼠模型，分析血清游离三碘甲状腺原氨酸 （free triiodothyronine，FT3） 、游离甲状腺素 （free throxine，FT4） 、总甲状腺素 （total thyroxine，TT4） 、促甲状腺激素 （thyroid-stimulating hormone，TSH） 及垂体促甲状腺激素β亚基 （thyroid-stimulating hormone β subunit，TSHβ） 蛋白和mRNA在低血糖应激后的动态变化，探讨低血糖应激对大鼠HPT轴的影响，为下一步研究应激对脑内神经内分泌的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取37只体质量280～320 g、8周龄SPF级Sprague Dawley雄性大鼠（ 购于北京维通利华实验动物技术有限公司） ，随机分成5组。0 min组（ n = 8） ：对照组，只进行置管术而不行钳夹试验；15 min组（ n = 7） 、30 min组（ n = 7） 、60 min组（ n = 7） 、90 min组（ n = 8） ：大鼠分别持续低血糖15、30、60、90 min后心脏采血，断头法处死大鼠，迅速分离并取出垂体组织，于-80℃冻存。

1.2 方法

1.2.1 血中激素测定：采用ELISA法检测血清FT3、FT4、TT4及TSH。

1.2.2 垂体TSHβ mRNA表达检测：采用实时荧光定量PCR。参照Trizol试剂说明抽提Sprague Dawley大鼠垂体总RNA，组织匀浆，两相分离，提取的RNA经沉淀、洗涤、溶解，并进行纯度鉴定。根据逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit（ 日本TaKaRa公司）的说明书，将抽提的总RNA逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR分析大鼠垂体组织中TSHβ mRNA表达水平。根据美国NCBI数据库的基因序列信息，在GenBank中找到相应基因序列，应用引物设计软件Primer 5.0分别设计出TSHβ和GAPDH基因的引物，由日本TaKaRa公司设计合成并纯化。应用LightCycler 480 Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0.，选择“Advanced Relative Quantification”分析路径对目的基因mRNA表达的差异进行分析。

1.2.3 垂体TSHβ蛋白表达检测：采用Western blotting。蛋白裂解液裂解垂体组织，离心15 min（ 12 000 g，4 ℃） ，取上清液行蛋白定量。总蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，50 V转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶中封闭5 h，一抗孵育过夜。于TBST溶液中洗膜后，置于二抗溶液中孵育2 h。采用DAB显色试剂盒显影并检测。以β-actin作为内对照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 低血糖应激后血清FT3水平

低血糖应激后15 min组和30 min组血清FT3升高，与0 min组比较差异有统计学意义（ P ＜ 0.05） ；60 min组血清FT3下降，较30 min组显著降低（ P ＜ 0.05） ；90 min组血清FT3测量值低于检测范围下限，以最小值进行统计学分析，较15 min组、30 min组显著降低（P ＜ 0.05） 。见表1。

2.2 低血糖应激后血清FT4水平

低血糖应激后，15 min组血清FT4升高，与0 min组比较差异有统计学意义（ P ＜ 0.05） ；30 min组、60 min组血清FT4轻度降低（ P ＞ 0.05） ；90 min组血清FT4较15 min组、30 min组、60 min组均显著降低（ P ＜0.05） ，较0 min组轻度降低（ P ＞ 0.05） 。见表1。

2.3 低血糖应激后血清TT4水平

低血糖应激后，15 min组、30 min组、60 min组血清TT4升高，与0 min组比较差异有统计学意义（ P ＜0.05） ，15 min组、30 min组、60 min组间比较血清TT4差异无统计学意义（ P ＞ 0.05） ；90 min组血清TT4较15 min组、30 min组、60 min组均显著降低（ P ＜ 0.05） ，较0 min组轻度降低（ P ＞ 0.05） 。见表1。

2.4 低血糖应激后血清TSH

60 min组血清TSH较0 min组、15 min组显著升高（ P ＜ 0.05） ；90 min组血清TSH下降，较0 min组、15 min组、30 min组、60 min组轻度降低（ P ＞ 0.05） ；其余各组间比较差异无统计学意义（ P ＞ 0.05） 。见表1。

2.5 大鼠垂体TSHβ mRNA表达水平

低血糖应激后，15 min组垂体TSHβ mRNA表达水平升高，与0 min组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05） ；其余各组间比较差异无统计学意义（ P ＞0.05） 。见表1。

2.6 大鼠垂体TSHβ蛋白表达水平

低血糖应激后，15 min组及30 min组垂体TSHβ蛋白均较0 min组显著增加（ P ＜ 0.05） ；60 min组、90min组垂体TSHβ蛋白表达水平较30 min组显著减少（P ＜ 0.05） 。见表1、图1。

表1 低血糖应激后血清FT3、FT4、TT4、TSH 及垂体TSHβ mRNA及蛋白表达水平的变化Tab.1 Changes in the serum levels of FT3，FT4，TT4，and TSH，and the mRNA and protein expressions of TSHβ in the pituitary gland after hypoglycemic stress

图1 Western blotting检测垂体TSHβ蛋白表达Fig.1 Expression of TSHβ protein in the pituitary gland detected by Western blotting

3 讨论

严重的低血糖可以改变大脑结构并导致脑损伤［4］、认知功能障碍［5］甚至猝死［6］。机体通过强大的反调节机制快速增加血糖水平，从而保护身体免受低血糖的危害。在绝对或相对高胰岛素血症的情况下，当葡萄糖水平降至80 mg/dL以下时，负反馈调节被激活［7］。低血糖的负反馈调节包括抑制内源性胰岛素分泌并增加胰高血糖素、儿茶酚胺 （肾上腺素、去甲肾上腺素） 、皮质醇和生长激素的分泌［8］，它们一起通过刺激肝葡萄糖产生和限制外周组织对血糖利用来增加血浆葡萄糖水平。低血糖时，大脑通过位于几个脑区域 （如下丘脑腹内侧核、下丘脑外侧的垂直区域、弧束核） 以及若干后脑区域中的葡萄糖传感神经元来感知脑内葡萄糖水平［9］。

甲状腺激素具有设定基础代谢率的能力，在饥饿期间抑制甲状腺激素会降低代谢率并保存能量储存，并通过快速抑制T4和T3水平来保存能量储存［10］。在禁食大鼠中，垂体Ⅱ型脱碘酶水平和肝脏Ⅰ型脱碘酶水平减少，并与从肝脏匀浆中分离出的外周T3减少相关［11］。尽管垂体和肝脏T3减少，但下丘脑Ⅱ型脱碘酶活性实际上随空腹增加而增加，导致来自弓形核的神经肽Y和刺鼠相关蛋白增加。因此，尽管禁食相关的外周甲状腺激素水平降低，但在禁食期间下丘脑内T3局部升高仍然存在，导致食欲信号显著增加，这反过来又作用于室旁核以减少促甲状腺激素释放激素 （thyrotropin-releasing hormone，TRH） 的产生。这被认为是尽管血清T4浓度降低，但血清TSH水平仍基本正常的机制［12］。SCHULTES等［13］的研究发现3.2 mmol/L水平的低血糖可以急剧降低垂体TSH释放，而不会伴随FT3和FT4水平的变化。后者可能是由这些甲状腺激素的半衰期长所致。血浆葡萄糖水平低于3.0 mmol/L时，FT3浓度降低。此外，低血糖应激对垂体-甲状腺轴的分泌活性具有延长的抑制作用。维持较长持续时间的较低血浆葡萄糖水平 （＜3.0 mmol/L），可引起血清FT3浓度和FT3/FT4比率的降低。这表明，低血糖除了通过减少T4向T3的转化而对其中枢即垂体和（或）下丘脑部位的抑制性影响外，还会急剧影响外周甲状腺激素代谢。

本研究发现低血糖应激15 min后血清FT3升高，30 min左右可升至高峰，低血糖持续60 min后血清FT3下降，90 min组血清FT3低于0 min组。血清FT4在低血糖应激15 min后升高，持续低血糖30 min后血清FT4降低，60 min时血清FT4继续降低，90 min时血清FT4降低至0 min组水平。低血糖应激15 min后血清TT4升高，低血糖持续30 min组血清TT4继续升高；60 min组血清TT4达最高值；90 min组血清TT4显著降低。低血糖应激30 min后血清TSH升高，60 min后血清TSH达最高值；之后血清TSH下降。低血糖应激15 min后垂体TSHβ mRNA表达水平升高。30 min后TSHβ蛋白表达升至最高，60 min后垂体TSHβ蛋白表达显著减少，90 min后垂体TSHβ蛋白表达继续减少，基本接近0 min组水平。本研究认为，在低血糖应激的初始阶段，低血糖能够兴奋HPT轴；而随着时间的延长，HPT轴逐渐被抑制。低血糖应激对HPT轴有抑制作用，但低血糖应激初始阶段甲状腺激素水平的变化仍有待进一步研究。既往的研究表明，温和的压力源可能会引起外周甲状腺激素水平轻微增加或没有变化，而更严重的压力源会导致甲状腺激素水平下降。这表明甲状腺激素的变化可能会对刺激的感知严重程度进行“分级”［14］。这可能解释了本研究中在低血糖应激的初始阶段，HPT轴表现为被刺激。

本研究探讨了低血糖应激后血清FT3、FT4、TT4、TSH水平及垂体组织TSHβ mRNA表达，但对下丘脑TRH的水平仍需要进一步研究。在以往的研究［15］中，起源于下丘脑室旁核的TRH神经元亚群将其轴突末端投射到紧邻垂体-门脉系统的毛细血管的正中隆起。TRH神经元在这些毛细血管中释放的TRH刺激垂体TSH的生物合成和分泌［10］。TRH神经元可从含有α促黑素细胞激素的下丘脑弓状核中的2个单独的瘦素反应神经元群接受直接单突触投射，合成可卡因和安非他明调控的转录物及神经肽Y和刺激相关蛋白［13］。在人和啮齿类动物中进行的几项研究［16］显示，禁食期间HPT轴被抑制，可能是由降低的血清瘦素浓度影响TRH神经元合成神经肽Y所介导的。

综上所述，低血糖应激可影响HPT轴，但其具体机制仍有待进一步研究和完善。这对指导低血糖的治疗、减少低血糖对患者的危害、降低发病率与死亡率具有重要意义。