慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织中NLRP3炎症小体表达水平的变化及意义*

杨文林，顾慧玲，倪红燕，王海峰

(上海市第一人民医院宝山分院呼吸科，上海 200940)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)作为一种常见的呼吸系统疾病，患病率高，死亡率高，已成为一种公共卫生问题。流行病学数据显示，若不能及时采取有效措施，在未来20年内，包括COPD在内的慢性疾病所致疾病负担将超过50%，严重影响患者的生活质量[1]。COPD的发病机制尚未完全阐明，且无特殊有效的治疗方法。从本质上讲，COPD是由Th1因子介导，巨噬细胞、中性粒细胞，CD8+T细胞等多种炎性介质共同参与的气道、肺血管及肺实质慢性炎性反应，其发生与免疫反应细胞及其炎症介质、细胞因子和黏附分子密切相关[2]。近年来，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体作为固有免疫系统的一种模式识别受体，与自身免疫疾病和感染性疾病的关系愈发引起关注[3，4]，但关于其在COPD的发生发展中的作用尚未明确。本研究通过建立COPD大鼠模型，分析NLRP3炎症小体在动物模型肺组织中的表达水平，探讨COPD的发病机制，为COPD的治疗提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar健康雄性大鼠30只，鼠龄12周，体重200±20 g，由第二军医大学实验动物中心提供，在清洁的二级动物房中饲养。

1.2 试剂和仪器 大前门牌香烟(上海卷烟厂)；Trizol(美国Invitrogen公司)；Prime ScritTMRT Reaent Kit；ELISA试剂盒(美国 Blue Gene公司)；ABI 7300 型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组及建立COPD大鼠模型：按随机数字表法分为吸烟组(n=20)和正常对照组(n=10)。吸烟组大鼠自实验第2天起置于自制箱(120 cm×80 cm×80 cm)内进行被动吸大前门牌香烟(焦油含量23 mg/支上海卷烟厂)，每天3次，第1天8支/次，第2，3天10支/次，第4天后15支/次，每次持续30 min，3次之间间隔至少3 h，连续75天。实验动物操作过程均遵照医院动物伦理委员会规程进行。选模后根据大鼠最大呼气流速(PEF)及气道肺组织病理变化分为吸烟COPD组(n=9)和吸烟非COPD组(n=11)。正常对照组大鼠自由饮水和摄食，喂养75天。

1.3.2 检测指标

1.3.2.1 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集：大鼠采用1 g/dl戊巴比妥钠腹腔内麻醉(33 mg/kg)。纵向剪开颈胸部皮肤和肌肉，暴露出气管和双肺。在气管下部做横行切口，夹闭右主支气管，通过硅胶管用注射器从气管缓缓注入无菌生理盐水3 ml灌洗左肺，每次注入后立即轻柔回吸得BALF，重复3 次。灌洗液纱布过滤，回收率为80%～90%。将BALF离心(4℃，2000 r/min，10 min)，细胞沉淀重新混悬于PBS液并制作4张细胞涂片，Wright-Giemsa染色做细胞计数和分类计数(至少计数200个细胞)，计算巨噬细胞(AMC)、中性粒细胞(NEU)和淋巴细胞(LYM)的绝对计数。

1.3.2.2 NLRP3炎症小体浓度的检测：应用人隐热蛋白NLRP3炎症小体的检测试剂盒，严格按说明书用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别测定BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度。

1.3.3 肺组织内NLRP3炎症小体mRNA表达的检测：采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，依照试剂盒说明书操作。按照Trizol-氯仿抽提法提取细胞总RNA，经MMLV酶逆转录得到cDNA模板，采用NLRP3炎症小体与β-actin二对引物在同一反应体系中进行PCR。通过基因库查找基因序列，引物设计使用Primer Premier 5软件。

2 结果

2.1 各组BALF中细胞分类计数结果比较 见表1。各组BALF中NEU，AMC，LYM计数比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与正常对照组比较，吸烟非COPD组、吸烟COPD组BALF中NEU，AMC，LYM计数明显升高，与吸烟非COPD组比较，吸烟COPD组BALF中NEU，AMC，LYM计数亦明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表1 各组细胞分类计数结果比较

2.2 各组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度及肺组织NLRP3 mRNA相对表达量比较 见表2。各组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与正常对照组比较，吸烟非COPD组、吸烟COPD组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度明显升高，与吸烟非COPD组比较，吸烟COPD组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度亦明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。吸烟非COPD组和吸烟COPD组肺组织NLRP3 mRNA相对表达量均显著高于正常对照组(P<0.05)。吸烟COPD组肺组织NLRP3 mRNA相对表达量显著高于吸烟非COPD组(P<0.05)。

表2 各组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度及肺组织NLRP3mRNA相对表达量比较

2.3 NLRP3炎症小体的表达与细胞分类计数的相关性 见表3。Spearman秩相关性分析显示，BALF，肺组织中NLRP3炎症小体浓度、肺组织NLRP3mRNA相对表达量与NEU，AMC，LYM计数均呈显著正相关(P<0.05)。

表3 NLRP3炎症小体的表达与细胞分类计数的相关性(r)

3 讨论

目前研究认为，气道与肺部的慢性炎症是导致COPD发生、发展的重要机制，但诱发炎症产生并大量扩散的机制尚不十分清楚[5]。NLRP3炎症小体是近年来研究最多的一种炎症小体，属于机体固有免疫的一部分，激活后可参与对外来病原体(细菌、病毒)的抵抗[6，7]。呼吸系统疾病的研究中发现炎症小体异常激活导致与疾病相关的慢性炎症的发生，在感染所致病原相关分子模式的信号刺激、氧化应激所致损伤相关分子模式的信号刺激下，机体炎性小体信号分子被激活，促进配体与NLRP3结合并形成NLRP3炎性小体，进而诱导白细胞介素-1β(IL-1β)，IL-18等大量炎性介质释放[8，9]。Mankan等[10]研究表明，小鼠中性粒细胞通过活化的NLRP3炎性小体分泌白细胞介素，其研究中检测到IL-1β和IL-18分泌增加。因此，学者推测NLRP3炎性小体可能参与了COPD的发生、发展过程，但国内外关于NLRP3炎性小体在COPD的BALF，肺组织等标本中表达水平及临床意义的研究仍较为少见。

本研究采用单纯香烟熏吸法成功建立COPD大鼠模型，BALF中炎症细胞计数与分类对于反映气道炎症具有重要意义。本研究结果显示，吸烟非COPD组、吸烟COPD组大鼠BALF中NEU，AMC和LYM计数明显高于对照组，且COPD模型较非COPD模型大鼠BALF中NEU，AMC和LYM计数亦明显升高(P<0.05)。香烟烟雾导致炎性细胞聚集于气道，一方面释放蛋白酶类和氧自由基，另一方面抑制抗蛋白酶类活性，从而破坏蛋白酶与抗蛋白酶的平衡，不断加重COPD相关肺损伤。冯一等[11]研究结果发现，在烟雾刺激下，NEU，AMC和LYM被大量诱导活化，大量蛋白酶类过度释放，参与了气道壁及肺泡壁结构的炎症、破坏及重塑等气道病理改变，最终导致COPD的发生。钟琳晔等[12]研究认为，NLRP3可能对肺泡巨噬细胞具有刺激作用，促进其合成和分泌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，刺激气道上皮细胞合成细胞外基质糖蛋白，参与COPD的发生发展。

ELISA分析结果发现，与正常对照组比较，吸烟非COPD组、吸烟COPD组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度明显升高，与吸烟非COPD组比较，吸烟COPD组BALF，肺组织中NLRP3炎症小体的浓度亦明显升高(P<0.05)。对肺组织的RT-PCR检测结果也得到相似的结论，COPD模型大鼠肺组织NLRP3 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)，进一步证实了NLRP3炎症小体作为一种肺组织特异性表达的炎症介质，可能参与了COPD病情的发生与发展，其机制可能与引起NEU，AMC，LYM等炎症细胞浸润以及炎性介质分泌有关[13，14]。此外，NEU，AMC和LYM计数与BALF，肺组织中NLRP3炎症小体浓度、肺组织NLRP3 mRNA相对表达量均呈显著正相关(P<0.05)。由此可见，NEU，AMC和LYM计数在气道内的聚集可导致NLRP3水平的升高[15]。

综上所述，香烟熏吸可诱发大鼠COPD，而NLRP3炎症小体在COPD的慢性炎症的发生、发展中发挥着重要作用，与肺组织炎性细胞以及气道病理改变密切相关，阻断NLRP3炎性小体的活化有望成为治疗COPD新的靶点和方向。