一种苏云金杆菌商品制剂菌种的分类鉴定

李景壮，曾 娟，聂天莹，肖 飞，段亚玲

（贵州省分析测试研究院，贵阳 550002）

随着人们对环境保护要求的提高，微生物农药成为今后农药的发展方向之一。苏云金杆菌是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌，具有专一性、高效和对人畜安全等优点。目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种，是世界上应用范围最广、用量最大、研究最多的微生物杀虫剂。

由于苏云金杆菌商品制剂种类繁多、应用广泛，因此，对市场上苏云金杆菌商品制剂产品进行分类鉴别尤为重要。本文建立了苏云金杆菌商品制剂菌株快速分离纯化的前处理方法和鉴定方法，为保证我国微生物农药产品质量，推动微生物农药的快速发展提供了科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 分离材料

以市场上购买的苏云金杆菌商品制剂（悬浮剂）为试验材料，4℃保存以确保制剂中微生物的生物活性。

1.2 培养基

形态特征及生理生化特征试验所用培养基采用细菌培养[1]。

1.3 主要试剂

75%乙醇水溶液、0.1%氯化汞甲醇溶液、牛肉膏、琼脂条、蛋白胨、NaCl，均为分析纯；Tris-HCl缓冲液、核酸染料GoldView、琼脂糖，北京鼎国生物技术有限公司；EX Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTP、10×EX Taq缓冲液，宝日医生物技术（北京）有限公司；引物10p primr1、引物10p primr2、DL 2000 DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒，北京新时代生物技术有限责任公司。

1.4 主要试验仪器

PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；凝胶成像仪、电泳系统，北京君意东方电泳设备有限公司；恒温水浴锅、PRX-250B人工气候培养箱，上海比郎仪器有限公司；医用离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；AL204电子天平，梅特勒-托利多公司；S-3400N扫描电镜，日本HITACHI公司；WP700TL23-K5格兰仕微波炉。

1.5 方法

1.5.1 分离、纯化与保存

制剂商品表面消毒方法按《微生物学实验手册》操作[2]。用无菌滴管吸取0.5 mL苏云金杆菌悬浮剂，放入盛有100 mL无菌水的烧杯中，制得10-1稀释液，然后按10倍的梯度稀释到10-6。取不同稀释倍数的菌悬液0.5 mL滴入平板培养基中，于28～30℃培养箱中混菌培养3～4 d。根据菌落的不同形态，在牛肉膏蛋白胨平板上进一步划线纯化、培养，然后将纯化后所得菌落转入装有牛肉膏蛋白胨的试管中，进行编号，4℃保存备用[3]。

1.5.2 苏云金杆菌的形态特征

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）、《微生物分类学》（1999版）、《常用细菌系统鉴定手册》（2001版）的方法，对苏云金杆菌进行形态学及生理生化特征鉴定。

1.5.3 菌株基因组DNA的提取及PCR反应条件

细菌菌株基因组DNA的提取：采用北京新时代生物技术有限责任公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

扩增引物：采用扩增细菌16S rDNA的通用引物27F/1492R[4]，由北京新时代生物技术有限责任公司合成，引物具体信息见表1。PCR反应体系总体积为50 mL，其中包括5.0 mL 10×EX Taq缓冲液、4.0 mL dNTP Mix（2.5 mM）、2.0 mL引物10p primr 1、2.0 mL引物10p primr 2、0.5 mL EX Taq酶（5u 2.0 mL模板Template）、36.5 mL无菌超纯水。

表1 引物序列

1.5.4 PCR产物电泳检测

称取0.24 g琼脂糖加入至30 mL 0.5×TBE缓冲液，用质量分数0.8%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。每孔点5 mL样品（3 mL PCR产物＋2 mL loading缓冲液），预留1个孔加入3 mLDL2000 DNAMarker，在80 V恒压下电泳50 min，电泳结束后将其放在凝胶成像系统下观察并照相。

1.5.5 切胶纯化、测序

将PCR产物纯化后送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序。获得的序列去除载体序列后，进行BLAST比对，结合形态学特征，确定菌株的类别。

1.5.6 DNA序列分析及发育树的构建

将测序获得的16S rDNA序列先提交到NCBI中，在GenBank中获得注册号，然后通过BLAST进行序列比对。根据同源性相似度差异，选取同源性较高的模式菌株，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，对分离菌株与数据库中登录的近源菌株系统发育关系进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离及生理生化特性鉴定

采用稀释法，根据菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的形态特征，经过多次划线分离纯化，得到纯化菌株，编号为D。

在显微镜下观察菌株D，其营养体细胞为杆状，较为粗壮，单生或双联体，并以双联体为单位连成短杆状。菌体运动活跃，形成芽孢和伴孢晶体。芽孢呈椭圆形，孢囊不膨大。伴孢晶体呈菱形、近圆形、方形、三角形或不规则形状，晶体大小不均。该菌落在牛肉膏蛋白胨、葡萄糖琼脂平板上扩展较快。菌株D电镜扫描图像如图1所示。

图1 菌株D的电镜扫描照片

菌株D的菌落外观为圆形，呈淡黄色透明状，表面湿润黏稠，边缘不规则，略有隆起。菌株D的菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性，有芽孢、鞭毛。菌株D的生理生化测定结果见表2。

表2 菌株D的生理生化特征

2.2 基于16S rDNA基因序列的系统发育分析和分子鉴定

通过BLAST比对后，与NCBI数据库中已收录的同源性较高的菌株进行核苷酸同源性比较。菌株D构建发育树所用各个物种16S rDNA的GenBank序列注册号见表3，构建的系统发育进化树见图2。

表3 菌株D构建发育树所用16S rDNA序列的注册号

从表3中可以看出：菌株D与Bacillus thuringiensis、Bacillus cereus、Bacillus sp.、Bacillus wiedmannii、Bacillus aryabhattai、Bacillus proteolyticus、Bacillus subtilis的相似性均为100%。从图2发育树中可以看出：菌株D的16S rDNA序列与芽胞杆菌属Bacillus中的Bacilluscereus strain（GenBank登录号为CP026678）在同一个分支上，亲缘关系最近，序列相似性为100%。

图2 基于16S rDNA序列菌株D的系统发育树

3 结论

本文建立了苏云金杆菌悬浮剂样品的前处理及菌种鉴定方法。该方法能够快速、简便、准确地对苏云金杆菌商品制剂的菌种进行鉴别，满足试验要求。根据菌株形态、生理生化特征及16S rDNA分析结果，该苏云金杆菌悬浮剂中菌株D为蜡质芽孢杆菌菌株（Bacillus cereus strain），而非苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis strain）。