1种野生多孔菌的分离鉴定及其高产漆酶培养基的筛选

郭 梁，徐伟良，李春冬，鲁 铁，郭元晟，钱俊平，孙建萍，雅 梅

(1.锡林郭勒职业学院，内蒙古 锡林浩特 026000；2.锡林郭勒生物工程研究院，内蒙古 锡林浩特 026000；3.锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心，内蒙古 锡林浩特 026000； 4.河南城建学院，河南 平顶山 467000)

多孔菌是一类子实层体呈孔状、质地为革质至木质的大型担子菌。多孔菌属于腐生或者寄生生物，广泛分布于世界各地。我国是多孔菌物种多样性最丰富的国家，目前已知的多孔菌共计704种，其中具有药用价值的多孔菌多达60余种[1-3]。我国对多孔菌的研究和应用历史悠久，主要集中在传统的中医药方面[4-5]。多孔菌中，灵芝(Ganodermalucidum)、茯苓(Wolfiporiacocos)、猪苓(Polyporusumbellatus)、桦褐孔菌(Inonotusobliquus)、桑黄(Inonotussanghuang)等都是著名的药用真菌。多孔菌除了药用和食用价值之外，在森林生态系统的天然更新中也起重要的作用[6-7]。多孔菌在生态系统中的功能主要依赖于其分泌的可降解木质素的酶类，比如漆酶、木质素过氧化物酶。另一方面，多孔菌还是树木的病原菌，通过腐生或者寄生的方式侵染活立木，影响树木正常的生长发育，甚至造成树木的大面积死亡[8]。因此，对野生多孔菌的资源调查和科学研究具有重要的生态效益和社会经济价值。对野生多孔菌的科学研究和资源开发离不开其菌种制备和种属鉴定。菌种的分离方法主要有组织分离、孢子分离、基质分离3类[9]。菌种鉴定、分离及固体和液体培养不仅影响野生多孔菌的人工栽培，而且影响其活性和药用成分的提取、鉴定及功能分析。

前期对内蒙古自治区锡林郭勒盟境内的蕈菌资源调查中，在锡林郭勒盟正蓝旗采集到1种野生多孔菌，对其进行分子鉴定。随后对该菌种进行组织分离，利用4种固体培养基、4种液体培养基对菌丝体进行培养，通过对菌丝体的生长状态、生长速度、菌丝生物量以及漆酶活性等指标进行评价，筛选最佳固体培养基和高产漆酶的液体培养基，为后续蕈菌资源的开发提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

EasyTaqPCR Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司，ITS引物由北京睿博兴科生物科技有限公司合成，基因组DNA快速抽提试剂盒购自上海生物工程股份有限公司，Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0购自大连Takara公司。

0.1 mol/L HAc-NaAc(pH值为4.0)缓冲液配制：取22 mL 0.l mol/L的NaAc母液(称量13.61 g NaAc·3H2O，蒸馏水定容至1 L)与78 mL 0.l mol/L的HAc母液(量取5.9 mL浓冰醋酸，蒸馏水定容至1 L)混合；0.5 mmol/L ABTS 溶液配制：0.013 7 g ABTS 溶于少量0.1 mol/L HAc-NaAc缓冲液中，并定容至50 mL。

固体培养基4种，其配方来自文献[10-13]。固体培养基A：马铃薯切片200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[10]；固体培养基B(经改良)：麦粒100 g(煮汁)、葡萄糖15 g、蛋白胨5 g、琼脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[10-11]；固体培养基C：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、琼脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[12]；固体培养基D(经改良)：葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、琼脂20 g，加水至1 000 mL，自然 pH值[13]。

液体培养基4种，其配方来自文献[14-16]。1号培养基：马铃薯切片200 g、葡萄糖20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[14]；2号培养基：马铃薯切片200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 000 mL，自然pH值[14]；3号培养基：葡萄糖30 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏5 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、维生素B1 0.01 g，加水至1 000 mL，自然pH值[15]；4号培养基：玉米粉30 g、蔗糖10 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 000 mL，自然pH值[16]。

1.2 仪器

YC-R50恒温培养摇床(天津市泰斯特仪器有限公司)、SW-J-2FD超净工作台(苏州市博莱尔净化设备有限公司)、HWS-250BX恒温恒湿培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、202-3A电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、Nanodrop 2000c核酸蛋白测定仪(美国Thermo Fisher公司)、2720 Thermal Cycler PCR扩增仪(美国ABI公司)、MLS-3751L-PC高温高压灭菌锅(日本SANYO公司)、5418R台式高速离心机(德国Eppendorf公司)、WD-9413B凝胶成像仪(北京六一生物科技有限公司)、UV9100A紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取 取20 mg干燥多孔菌子实体，用液氮研磨成粉末，转移到1.5 mL离心管中；加入400 μL Buffer Digestion和4 μL β-巯基乙醇，振荡混匀，65 ℃水浴1 h；加200 μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；室温10 000 r/min离心5 min，将上清液转移到新的1.5 mL离心管中；加入等体积异丙醇颠倒混匀，室温放置2～3 min，室温10 000 r/min离心5 min，弃上清；加1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗后10 000 r/min离心2 min，弃上清；重复上一步骤；开盖，室温倒置5～10 min，至残留的乙醇完全挥发；用50 μL ddH2O溶解DNA。利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪测量其浓度，将样品母液稀释至300 ng/μL左右，-20 ℃保存。

1.3.2 PCR扩增 以提取的基因组为模板，选用正向引物和反向引物进行扩增。引物序列如表1所示。PCR反应体系(20 μL)：模板 1 μL、正向引物和反向引物各 1 μL、EasyTaqPCR Super Mix 10 μL、ddH2O 7 μL。PCR反应程序：第1阶段，95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s、69 ℃退火 30 s(每循环降低退火温度1 ℃)、72 ℃延伸 1 min，15 个循环。第2阶段，95 ℃变性 30 s、47 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，20 个循环；73℃加强延伸 1 min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 真菌ITS通用引物

1.3.3 序列测序比对 将PCR 扩增产物用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 进行回收。具体步骤：在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，置于EP管中，向胶块中加入溶解液 Buffer GM，振荡混合，放入50 ℃金属浴中溶解胶块；将溶解的胶块溶液转移至Spin Column，12 000 r/min离心1 min，弃滤液；再将700 μL的Buffer WB加入 Spin Column中，室温12 000 r/min离心1 min；重复上述操作1次；将Spin Column安置于新的EP管上，在Spin Column膜的中央加入30 μL灭菌蒸馏水静置1 min，室温12 000 r/min离心1 min洗脱DNA。将回收的DNA扩增产物送至北京睿博兴科生物科技有限公司，用相同引物进行测序。测序结果经拼接后在 NCBI 数据库中进行BLAST同源比对。

1.3.4 菌种分离与固体培养基的筛选 选取野生多孔菌菌柄与菌盖的连接处进行组织分离培养，分别接种到选定的4种固体培养基上，于25 ℃恒温培养箱中进行初步培养。在长满菌丝的培养皿中，用打孔器取长势相似、大小相同的菌丝块重新接到新的4种固体培养基上进行培养，观察菌丝生长状态，每天测量记录菌丝生长长度，至菌丝全部长满培养皿为止，并对培养的菌丝进行分子鉴定。将最终培养的4种固体培养基于电磁炉上煮沸1 min，使琼脂溶解，取出过滤(6层无菌纱布)。将菌丝放入已经预先称量过的培养皿(质量为A0)中，置于电热鼓风干燥箱中，80 ℃烘干至恒质量，称量皿与菌丝(总质量为A1)，计算菌丝质量(A1-A0)。根据该多孔菌在4种固体培养基上的生长速度、菌丝干质量筛选最优固体培养基配方。

1.3.5 菌丝体液体培养基的筛选 将固体培养的菌丝接种于4种选定的液体培养基(100 mL)中，于25 ℃恒温培养摇床中进行培养。培养6 d后，测定其生物量及漆酶活性。培养7 d后，取出过滤(8层无菌纱布)，将菌丝放入80 ℃电热恒温干燥箱中烘干，测量菌丝生物量。根据该多孔菌在4种液体培养基上的生物量、发酵液中的漆酶活性筛选最优液体培养基配方。

1.3.6 菌丝体的漆酶活性测定 菌丝体的漆酶活性测定参照文献[17-20]。粗酶液制备：取4种液体培养基摇瓶培养的菌液，用 8 层无菌纱布过滤发酵液，并将滤液25 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清，即为粗酶液。ABTS测定漆酶活性：设计3 mL反应体系，含2 700 μL HAc-NaAc、200 μL ABTS、100 μL粗酶液。2 700 μL HAc-NaAc与200 μL ABTS相混，30 ℃ 恒温水浴 10 min 后，加入 100 μL酶液启动反应。根据预实验确定吸光值的有效范围为0.1～0.8。测定吸光值：每隔30 s测量样品酶液420 nm下的OD值，共测量3 min。以100 μL粗酶液沸水浴15 min去除酶活性，作为空白对照。

酶活性定义：在1 min内使l μmol ABTS氧化所需的酶量即为1个酶活性单位(U)，计算公式如下：

酶活性(U/L)=N×ΔOD420×106/(36 000×3)

公式中，N为稀释倍数，ΔOD420为420 nm下吸光度的变化值，36 000为ABTS氧化态的摩尔吸光系数[L/(mol·cm)]。

2 结果与分析

2.1 野生多孔菌子实体的采集和分子鉴定

将采集到的野生多孔菌子实体(图1)与分离培养的菌丝体分别利用正向引物和反向引物(表1)，设置3个平行试验，进行PCR反应，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(图2)。由图2可知，子实体与菌丝体的3个平行均在600～700 bp处有ITS序列片段。经序列测序后，在NCBI数据库中进行BLAST比对，并利用该菌的ITS序列与数据库中已经存在的序列做同源比对(图3)。结果表明，该菌种与Coriolopsistrogii(KX394807.1)、Trametestrogii(GU166280.1)、Funaliatrogii(EU273516.1)相似性最高，核酸序列的一致性均为100%，即所采集的多孔菌为硬毛粗盖孔菌。

图1 野生多孔菌子实体

图2 野生多孔菌PCR产物电泳结果

图3 野生多孔菌序列同源比对

2.2 野生多孔菌菌种的分离和固体培养基的筛选

以4种固体培养基对该种多孔菌进行培养，观察记录菌丝在固体培养基上的生长状态，并通过菌丝生长速度和菌丝干质量的统计分析筛选出最适合该种多孔菌生长的固体培养基配方，结果见图4—5及表2。该种多孔菌在固体培养基B上的生长速度最快，培养至第7天时，皿内菌丝已接近全部长满，而固体培养基C、D上的菌丝生长速度略慢，培养至第9天时才全部长满培养皿表面。从菌丝长势来看，固体培养基C、D上的菌丝长势较好，固体培养基A、B上的菌丝长势略差。通过菌丝干质量比较，固体培养基D上培养的菌丝干质量最大，为0.132 g，而固体培养基B上培养的菌丝干质量最小，为0.033 g，说明固体培养基C、D上的菌丝生物量积累较多。综合以上试验数据，最终确定固体培养基D为该种野生多孔菌的最优固体培养基配方。

图4 野生多孔菌菌丝在4种固体培养基上的生长状态

图5 野生多孔菌在4种固体培养基上的菌丝长度与干质量变化

表2 野生多孔菌在4种固体培养基上的菌丝生长状况

注：+++表示菌丝粗壮、密，长势良好；++表示菌丝较粗壮、较密，长势较好；+表示菌丝微粗壮、密，长势好。

2.3 野生多孔菌高产漆酶液体培养基的筛选

4种液体培养基上该种多孔菌的生物量(柱状图)及漆酶活性(折线图)见图6。4号液体培养基上培养的菌丝生物量最大，为10.43 g/L，而1号、2号、3号液体培养基上培养的菌丝生物量分别为4.16、8.56、6.92 g/L，其中1号液体培养基上培养的菌丝生物量最小。2号液体发酵液中漆酶活性最高，达907.34 U/L，而1号、3号、4号液体发酵液中漆酶活性分别为212.87、60.83、70.18 U/L，其中3号液体发酵液中漆酶活性最小。通过菌丝生物量及液体发酵液中漆酶活性的比较分析，最终确定2号液体培养基为该种多孔菌发酵液产漆酶的最佳培养基配方。

注：柱状图为菌丝生物量；折线图为漆酶活性图6 野生多孔菌在4种液体培养基中的菌丝生物量及发酵液中漆酶活性

3 结论与讨论

通过分子鉴定、固体培养基筛选、高产漆酶的液体培养基筛选，对内蒙古自治区锡林郭勒盟正蓝旗地区采集的1种野生多孔菌进行了研究。结果表明，该种野生多孔菌菌株与Coriolopsistrogii(KX394807.1)、Trametestrogii(GU166280.1)、Funaliatrogii(EU273516.1)的ITS一致性为100%，因此，该种野生多孔菌为硬毛粗盖孔菌。通过固体培养基的筛选，最终确定固体培养基D(葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、琼脂20 g，加水至1 000 mL,自然pH值)为该种多孔菌的最佳固体培养基配方；以漆酶活性等为指标，进行液体培养基的筛选，最终确定2号液体培养基(马铃薯切片200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 000 mL,自然pH值)为该种多孔菌发酵产漆酶的最佳液体培养基配方，漆酶活性可达907.34 U/L。锡林郭勒盟除了优质的草腐蕈菌，还有具高药用功能及生物开发价值的木腐多孔菌种质资源，硬毛粗盖孔菌的发现、鉴定、培养及高产漆酶液体培养基的筛选可为后续蕈菌资源的开发提供借鉴。同时，该种硬毛粗盖孔菌具有菌丝生长快、漆酶产量高的特点，可以作为高产漆酶的候选工程菌株进行后续研究和开发。