互花米草BADH基因的克隆与定量表达分析

刘 振，张 侠，尹海波，陈世华，郭善利

(烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005)

长期以来，对土地不合理的利用(不合理轮作、过度施用化肥、不合理浇灌、过度放牧等)及对植被资源的过度开采，导致土地受到不同程度的盐渍化威胁，荒漠戈壁滩的面积也不断扩大，同时，盐渍化和干旱也成为制约农业发展的重要非生物胁迫因素。因此，如何有效地开发利用盐碱地、干旱地成为社会关注的重点。

互花米草(Spartinaalterniflora)是一种禾本科米草属的多年生草本植物，适宜生长在潮间带，起源于美国大西洋沿岸和墨西哥湾，引进中国后主要分布在沿海滩涂地带。互花米草叶互生、具盐腺，是挖掘耐盐基因良好的生物材料。1996年Wood等[1]研究发现，禾本科植物含有甜菜碱醛脱氢酶基因。甘氨酸甜菜碱(Glycine betain，以下简称甜菜碱)是以胆碱为底物，丝氨酸为原料，在胆碱单加氧酶的催化下先生成甜菜碱醛，再通过甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的氧化作用生成的[2-3]。甜菜碱作为植物中重要的渗透调节剂，在植物遭受盐碱、干旱等逆境胁迫时，帮助植物维持细胞渗透平衡，并可保护蛋白酶活性，激活抗逆基因表达，显著提高植物的抗逆能力。目前已从菠菜[4]、辽宁碱蓬[5]、异苞滨藜[6]、大麦[7]、结缕草[8]、盐节木[9]、柳树[10]等植物中克隆出BADH基因。将BADH基因转入小麦[11]、水稻[12]、大豆[13]、玉米[14]、棉花[15]、羽衣甘蓝[16]等植物使其耐盐性或耐旱性得到不同程度的提高。本研究拟从盐生植物互花米草中克隆BADH基因，对其进行生物信息学及表达分析，为进一步研究其耐逆功能和分子机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

互花米草种子采集于山东莱州海滨，浸泡处理后4 ℃保存。将保存的种子种植于基质中(1/2椰土+1/2黑土)，在25 ℃、光照/黑暗为16 h/8 h的环境下培养2周。取长势一致的植株移到小方盆中，继续培养至4～5叶龄[17]。用600 mmol/L的NaCl溶液浇灌4～5叶龄幼苗48 h，剪取幼嫩叶片，液氮速冻后-80 ℃保存，用于BADH基因的克隆。用600 mmol/L的NaCl溶液、20%的 PEG溶液分别对幼苗进行浇灌和喷洒处理，分别胁迫0、3、6、12、24、48 h，每个处理重复3次。洗样，剪取幼嫩叶片，液氮速冻后-80 ℃保存，用于BADH基因的表达分析。

大肠杆菌DH5α为烟台大学植物发育分子生物学实验室保存；PCR相关试剂、pMD18-T Vector、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa；BIOZOL RNA Kit购自BIOFLUX公司；Reverse Transcriptase试剂盒购自Promega公司；氨苄青霉素购自Sigma公司；其他试剂多为国产分析纯；引物由北京华大六合基因公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 互花米草BADH基因的克隆 取冻存的用于基因克隆的互花米草叶片，液氮研磨，利用BIOZOL RNA Kit提取RNA，使用超微量紫外分光光度仪检测其纯度和浓度，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。利用Reverse Transcriptase试剂盒体外反转录合成cDNA。根据烟台大学植物发育分子生物学实验室转录组测序结果，获得BADH基因的中间片段，在此基础上设计RACE引物(S31-BADH：5′-CCAAGATTACTGAGAGGAAGCCTG-3′；S32-BADH：5′-CCACCTTCAGAGAGACCCTATTGG-3′；S51-BADH：5′-CCAATAGGGTCTCTCTGAAGGTGG-3′；S52-BADH：5′-CAGGCTTCCTCTCAGTAATCTTGG-3′)，以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，30个循环；68 ℃充分延伸10 min。DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，加尾，与pMD18-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，酶切，挑选阳性克隆送华大基因公司测序。比对分析测序结果，拼接获得互花米草BADH全长cDNA序列，登陆NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Blast比对，确认其为互花米草BADH基因，将其命名为SaBADH基因。根据拼接获得的全长cDNA序列，设计引物(SaBADH1-oxF：5′-CTCTAGACACCCAAAGCCCAAGCTCAGTG-3′；SaBADH1-oxR：5′-GGTACCCACACGACTTCAGCACATGGTAC-3′)，以cDNA为模板，扩增SaBADH基因。反应条件为：94 ℃预变性7 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸120 s，35个循环；68 ℃充分延伸10 min。将扩增产物回收，加尾，连接，转化，酶切，挑选阳性克隆送测序，确认获得正确的SaBADH基因的pMD18-T 克隆载体。

1.2.2 互花米草BADH基因的生物信息学分析 利用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行Blast比对分析，取部分高度相似(相似度>70%)的同源序列，利用MEGA 6进行同源序列比对，构建N-J进化树，分析SaBADH与其他植物BADH的进化关系。利用Expasy软件(https://web.expasy.org/protparam)分析SaBADH蛋白的基本理化性质。利用PredictProtein软件(https://www.predictprotein.org/)预测SaBADH的二级结构和亚细胞定位。利用InterProScan软件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析蛋白质的结构域。利用SWISS-MODEL软件(https://swissmodel.expasy.org/)进行三维建模，预测其三级结构。

1.2.3 互花米草BADH基因的表达分析 取冻存的用于表达分析的互花米草叶片，用BIOZOL RNA Kit提取RNA，用Reverse Transcriptase试剂盒合成cDNA，稀释20倍作为qRT-PCR的模板。根据SaBADH基因的cDNA全长序列，设计定量引物(SaBADH-RTF：5′-TAAGTGGTCACAGCACACGGAAC-3′，SaBADH-oxR：5′-GGTACCCACACGACTTCAGCACATGGTAC-3′)。以tub为内参，进行PCR反应得到扩增曲线。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40个循环)。循环结束后，从72 ℃缓慢升温至95 ℃获得熔解曲线。

1.3 数据分析

采用Excel 2003软件绘图，利用SPSS 19.0软件进行统计分析。本研究采用单因素方差分析，进行方差齐性检验和LSD分析。

2 结果与分析

2.1 互花米草BADH基因的克隆

采用RACE技术获得的SaBADH基因的两端序列见图1，将其与本课题组实验室通过转录组测序得到的中间片段进行拼接，得到SaBADH基因cDNA的全长序列，在NCBI网站进行Blast比对，发现SaBADH与细叶结缕草、二穗短柄草、高粱氨基酸的BADH相似性分别达到96%、87%、86%，且氨基酸数量基本相同，确认拼接得到了SaBADH基因。根据SaBADH基因cDNA的全长序列设计引物，以cDNA为模板，扩增SaBADH基因(图1)，获得SaBADH的克隆载体pMD18-T ∶∶SaBADH。

M：Marker 2000 plus；1：互花米草SaBADH基因5′RACE产物；2：互花米草SaBADH基因3′RACE产物；3：互花米草SaBADH基因全长产物图1 互花米草SaBADH基因电泳结果

2.2 互花米草BADH基因的生物信息学分析

SaBADH基因的cDNA全长1 983 bp，开放阅读框1 515 bp，编码504个氨基酸(图2)。Expasy软件预测SaBADH蛋白分子质量为54.388 ku，理论等电点为5.45，不稳定系数为33.37，脂肪系数为88.89，平均亲水系数为-0.080，为稳定的亲水性蛋白[18]。PredictProtein软件预测SaBADH蛋白的二级结构由43.65%的H、17.06%的E、39.29%的L组成，SaBADH蛋白定位于叶绿体。InterProScan分析SaBADH具有碱醛脱氢酶结构域。SaBADH的三级结构预测显示其为椭球形。SaBADH的Blast比对发现，互花米草与细叶结缕草、二穗短柄草、高粱的相似性达到86%以上。从N-J进化树(图3)中可知，互花米草BADH与结缕草属细叶结缕草BADH亲缘关系最近，其次是短柄草属二穗短柄草、高粱属高粱、蜀黍属谷子等禾本科单子叶植物的BADH，与棉花、山萮菜等双子叶植物的BADH亲缘关系较远。

单下划线为叶绿体定位序列；双下划线为十缩肽；阴影为酶功能相关残基；*为终止密码子图2 互花米草BADH的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列

图3 互花米草和其他植物的BADH系统进化树

2.3 互花米草BADH基因的表达分析

对在600 mmol/L NaCl和20% 的PEG不同胁迫时间处理下的互花米草的qRT-PCR分析结果表明(图4)，随着处理时间的延长，SaBADH基因的表达呈现先上升后下降的趋势，分别在处理24、12 h时达到最大值，分别为对照的7、4倍，且与对照相比差异达到极显著水平，表明SaBADH受NaCl、PEG诱导表达，这与互花米草的耐盐耐旱有密切关系。

*、**分别表示在0.05、0.01水平差异显著图4 互花米草BADH在NaCl、PEG胁迫下的定量表达分析

3 结论与讨论

BADH是甜菜碱合成过程中的关键酶，在植物耐逆过程中起重要作用[18-20]，随着全球土地盐渍化和干旱等非生物胁迫因素的加剧，研究植物的耐逆基因意义愈发重大。目前，已经克隆出多种植物耐逆相关基因，主要有渗透物质合成酶基因、功能蛋白基因、信号转导相关基因等[21]。本研究通过RACE技术，从互花米草中克隆出BADH基因的全长cDNA序列。生物信息学分析预测SaBADH为稳定的具有椭球形三级结构的亲水性蛋白，定位于叶绿体。已有报道指出，BADH定位于叶绿体的序列为QLFIDGE[22]，推测SaBADH蛋白的氨基酸序列中的QLFIGGE指导其定位到叶绿体。InterProScan分析SaBADH具有碱醛脱氢酶结构域。有报道指出，碱醛脱氢酶结构域有保守的VTLELGGKSP十缩肽[23]，推测SaBADH蛋白的氨基酸序列中VSLELGGKSP是该酶的保守十缩肽。系统进化分析显示，SaBADH是序列保守的蛋白质，单子叶与双子叶BADH、禾本科与非禾本科BADH在进化上有一定的差异，这与植物分类学上的亲缘关系一致。为进一步探讨SaBADH的耐盐机制，本研究利用qRT-PCR仪对SaBADH在600 mmol/L NaCl、20%的PEG胁迫处理下的表达量进行了相对定量表达研究。结果发现，SaBADH的相对表达量发生了很大变化，这说明SaBADH受NaCl、PEG诱导表达。在NaCl胁迫处理时，随着处理时间的延长SaBADH的相对表达量逐渐增加，处理24 h时达到最大，约为对照的7倍，且差异达到极显著水平，之后SaBADH的相对表达量下降；在PEG胁迫处理时，随着处理时间的延长SaBADH的相对表达量逐渐增加，在处理12 h时达到最大，约为对照的4倍，且差异达到极显著水平，之后SaBADH的相对表达量下降。由此可见，SaBADH在盐胁迫和干旱胁迫下基因表达上调，通过增加SaBADH的表达量来抵御盐和干旱胁迫对自身的毒害，这与互花米草在植物耐逆机制方面有较保守的功能密切相关。

随着土壤盐渍化和干旱问题的日益严重，利用基因工程技术培育耐盐耐旱新品种对于开发利用盐碱、干旱土地有重要意义。本实验室下一步将构建SaBADH的过量表达载体，转模式植物拟南芥，进一步研究SaBADH的耐逆功能与分子机制。