干扰素调节因子8在慢性阻塞性肺病中作用及其机制

周淼 焦莉 孙俊波

1河南中医药大学呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心（郑州 450046）；2河南中医药大学第三附属医院肺病科（郑州 450008）；3河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）内科（郑州 450002）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种由多种原因引起的慢性气道炎性疾病。COPD主要特征为不完全可逆的持续气流受限。形成气流受限的原因在于气道重塑和肺泡破坏，与气道上皮炎性侵润和连续的组织破坏有密切关系［1］。

干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8，IRF-8）是一种核转录因子，能够调节干扰素的表达。IRF-8参与多种病理生理过程，如宿主免疫、细胞生长、分化和肿瘤发生［2］。IRF8能够显著促进炎症因子的分泌［3］。LANGLAIS 等［4］表明巨噬细胞中IRF-8是防止感染所必需的，并且与慢性炎症有关。然而，对于IRF-8在COPD中的作用却未见相关报道。

microRNA作为COPD的治疗靶点受到越来越多的关注。miRNA微阵列分析结果表明miR-218在COPD患者肺组织中明显降低，其表达与气道阻塞显著相关［5］。SCHEMBRI等［6］表明与不吸烟者相比，miR-218在吸烟者人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells，HBEC）中显著下降。上述研究提示miR-218可能在COPD发生发展中发挥作用。

因此，本文通过敲除IRF-8，探究IRF8对HBEC炎症和增殖的调节作用及机制以期为COPD的治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料2016年10月到2017年3月，收集河南中医药大学第三附属医院肺病科住院的21例COPD患者。其中女9例，男14例，年龄45～67岁，所有患者均符合2013年中华医学会呼吸病学分会制定的COPD诊断标准［7］。对照组为同期在本院呼吸科的12例健康体检者，其中女5例，男7例。所有患者在治疗前2周均未使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂，入选患者排除支气管哮喘、肺间质纤维化等呼吸系统疾病及合并有严重肝肾疾病、肿瘤及血液系统疾病。两组患者在年龄，性别比例上无显著差异。

1.2 实验材料Trizol试剂和Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；BEGM培养基（德国Promocell）；IRF8-NC及IRF8-siRNA（上海吉玛制药技术有限公司）；PrimeScript RT reagent kit，SYBR Green mix（大连宝生物工程公司）；PVDF膜（Millipore，USA）；抗人IRF8抗体、p65和p-p65抗体（Santa Cruz公司）；MTT试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 诱导痰的制备诱导前测定FEV1值并吸入200 μg沙丁胺醇，然后用3%的无菌高渗盐水为患者进行雾化10～20 min，收集痰液于无菌干燥痰杯中。随后用镊子取出痰液黏稠、密度大的部分，称重后，加入痰液重量4倍体积的0.1%二硫苏糖醇（DTT）；反复吹打数次后，置于37℃震荡30 min。用48 μmol/L尼龙网过滤。4℃，1 200 r/min离心10 min后吸取痰上清，并于-80℃冻存待用。

1.3.2 HBEC的采集及培养选择受试者2～3级支气管进行刷检，并收集细胞于预冷的BEGM完全培养液中。经100目和200目筛网过滤以去除黏液，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清后用BEGM完全培养基配制成细胞悬液。置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3.3 细胞转染及实验分组取对数生长期的HBE细胞接种于6孔培养板（2×105/孔），待细胞融合至80%，按照Lipofectamine 2000试剂说明书转染IRF8-siRNA或其对照（IRF8-NC），48 h后检测细胞中IRF8的表达水平以验证转染效果。实验分为4组：Control组（健康对照者HBEC），COPD组（COPD患者HBEC），NC组（COPD患者HBEC转染IRF8-NC），IRF8-siRNA组（COPD患者HBEC转染IRF8-siRNA）。

1.3.4 实时定量PCR用Trizol试剂抽提细胞总RNA。随后按照PrimeScript RT reagent kit说明书合成cDNA。采用SYBR Green mix于ABI 7500进行实时定量PCR反应。

1.3.5 Western blot收集细胞裂解液并测定蛋白浓度。选取20 μg蛋白经10%SDS-PAGE分离后电转到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。随后将膜分别与IRF8、p65、p-p65及GAPDH抗体4℃孵育过夜，随后加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体继续室温孵育1 h。用ECL发光系统检测目的条带。用Image Pro Plus 6.0软件进行灰度分析。

1.3.6 酶联免疫吸附实验检测TNF-α、IL-6及IL-8的浓度收集细胞培养液，离心后收取上清液，按1∶100稀释后加入酶标反应孔中，37℃孵育1 h。洗涤后每孔加入100 μL酶标抗体，再次37℃孵育1 h，每孔加入100 μL TMB-过氧化氢尿素溶液，37℃下避光放置5 min，加入50 μL终止液，测定各孔在450 nm处的吸光值。

1.3.7 细胞增值实验将细胞接种于96孔板（5×104个/孔），然后向每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）和200 μL二甲基亚砜。酶标仪测定490 nm处吸光值。

1.3.8 荧光素酶报告实验构建IRF8-3′UTR报告基因质粒，并将其与miR-218 mimic或miR-218 control共同转染HEK293细胞。转染48 h后，采用荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0分析，计量资料用表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1IRF8表达水平及其与气流受限相关性分析健康对照者与COPD患者诱导痰上清液中IRF8水平分别为（5.87±0.93）ng/mL、（6.73±1.05）ng/mL，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与健康对照者相比，COPD患者HBEC中IRF-8的表达水平显著升高（P＜0.05；图1A）。相关性分析结果显示，HBEC中IRF8表达量与FEV1占预计值的百分比（FEV1%）呈显著负相关（r=-0.73，P＜0.001；图1B）。

图1 IRF-8表达水平及其与FEV1%相关性分析Fig.1 The expression of IRF-8 and its correlation with FEV1%

2.2 IRF8的低表达显著降低了HBEC中炎症因子的水平siRNA转染后，IRF8-siRNA组中IRF8的mRNA及蛋白水平显著降低（P＜0.01）（图2）。ELISA实验表明与健康对照者相比，COPD患者诱导痰上清液及HBEC中TNF-α、IL-6和IL-8水平明显升高（表1和图3）。IRF8低表达可降低TNF-α、IL-6和IL-8的水平（图3）。

表1 酶联免疫吸附实验检测受试者诱导痰上清液TNF-α、IL-6和IL-8水平Tab.1 The level of IL-6，IL-8 and TNF-α in the supernatant of medium analyzed by ELISA ±s

表1 酶联免疫吸附实验检测受试者诱导痰上清液TNF-α、IL-6和IL-8水平Tab.1 The level of IL-6，IL-8 and TNF-α in the supernatant of medium analyzed by ELISA ±s

注：与健康对照组比较，aP＜0.05

组别健康对照组COPD组TNF-α（pg/mL）87.5±51.3 165.7±68.1a IL-6（pg/mL）70.6±19.8 158.3±60.7a IL-8（ng/mL）2.1±0.7 11.5±3.6a

2.3 IRF8低表达对细胞增殖能力的影响如图4所示，与Control组相比，COPD患者HBEC细胞增殖能力明显增加。IRF8低表达可降低细胞的增殖能力。

2.4 IRF8的低表达激活了NF-KB信号通路与Control组相比，COPD组p-p65表达水平显著升高。而IRF8的低表达显著抑制了p-p65的蛋白表达水平（P＜0.05，图5）。

图2 各组IRF8表达水平Fig.2 The expression of IRF8 in each group

图3 酶联免疫吸附实验检测各组IL-6、IL-8和TNF-α水平Fig.3 The level of IL-6，IL-8 and TNF-α in each group detected by ELISA

2.5 miR-218靶向作用于IRF8生物信息学工具microRNA.org和Targetscan预测显示miR-218可能靶向作用于IRF8。RT-qPCR结果显示COPD患者HBEC中miR-218水平显著高于健康对照者组（图6A）。荧光素酶报告实验发现miR-218 mimic可显著降低野生型荧光素酶报告基因的荧光强度（P＜0.01；图6B），但对突变型荧光素酶报告基因的荧光强度无影响（P＞0.05；图6B）。过表达miR-218也可显著抑制IRF8的mRNA及蛋白水平（图6C-D）。

图4 MTT实验检测各组细胞增殖能力Fig.4 The cell viability was detected by MTT assay

3 讨论

图5 各组p65表达水平Fig.5 The expression of P65 in each group

图6 miR-218靶向调节IRF8Fig.6 miR-218 targeted regulation of IRF8

气道重塑和肺泡破坏是气流受限的主要原因。气道上皮细胞作为与环境的重要接口，其损伤是导致气道重塑的典型病理特征［8］。本研究发现IRF8在COPD患者诱导痰及HBEC中显著升高，并与FEV1%呈负相关性。IRF8可通过激活NF-κB通路从而促进炎症反应，提高HBEC增殖能力。另一方面，miR-218可靶向作用于IRF8。

IRF8属于干扰素调节因子家族一员，在干扰素信号转导方面发挥着重要的作用［9］。当暴露于脂多糖和外在微生物产物时，IRF8可激活或抑制病原体应答转录程序［9］。另一方面，干扰素调节因子家族的其他成员与COPD的发生有关。IRF7在鼻病毒感染的COPD培养物中显著增加［10］。IRF3蛋白在感染合胞病毒的A549细胞中增加［11］。COPD作为一种慢性气道炎性疾病，其发生发展过程是否与IRF8有关尚不清楚。本研究结果显示，IRF8在COPD患者诱导痰及HBEC中显著升高。这一结果与GRIET等［5］的发现一致。之前研究发现IRF8在多种炎性疾病异常表达并参与疾病的病理过程［3，12］，提示 IRF8 在炎性疾病中的重要作用。本文研究发现低表达IRF8能够有效地抑制COPD细胞的炎症反应。ISHII等［13］发现IRF3-/-小鼠肺部炎性介质下调，肺气肿形成受到抑制。IRF8在动物体内是否有相同的作用还有待研究。

NF-κB通过调节细胞因子、趋化因子和细胞粘附分子的表达而在气道病理学中起重要的作用。长期香烟烟雾或脂多糖刺激可增加IKK α/β的磷酸化及NF-κB的激活，促进炎症因子的表达［14］。本研究发现在COPD患者诱导痰及HBEC中p65的磷酸化水平升高，与DI等［15］的研究结果相似。抑制IRF8的表达可显著降低p65的磷酸化水平。研究表明IRF8基因敲除小鼠由于缺乏与IL-12 p40启动子（含CACCC位点）的结合，IL-12 P40表达下调［12，16］。而 p40启动子上含有 NF-κB 转录因子结合位点［17］，因而笔者推测抑制IRF8可能是通过下调IL-12 p40而导致p65磷酸化水平降低。上述结果提示IRF8是通过NF-κB通路调控炎症反应，进而参与COPD的进程。

综上所述，本文研究揭示了IRF8作为炎症反应的重要参与者在COPD治疗中的重要作用。IRF8的抑制可为COPD的治疗提供新的思路和理论依据。COPD是一个多因素作用的结果，因而动物水平IRF8在COPD发生中的作用有待进一步研究。