硫酸右旋糖酐抑制人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用

高文卫 金秀 田润玲 黄允宁 徐远义

1宁夏医科大学（银川 750001）；2济宁医学院附属医院（山东济宁 272029）；3宁夏宁安医院（银川750041）；4宁夏回族自治区人民医院（银川 750021）

胃癌的发病率和死亡率居于全世界的消化道肿瘤前列，并且呈年轻化趋势［1-2］。化疗药物治疗成为胃癌腹腔内种植转移的主要治疗手段，但到目前疗效并不显著。所以，目前亟待寻找新的有效治疗胃癌腹膜种植转移的抗癌药物，并对其作用机制进行研究。

硫酸右旋糖酐（dextran sulfate，DS）是大分子右旋糖酐，分子量500 000。国外从1997年开始研究DS的抗癌作用，研究表明DS在腹腔内不易被吸收，且作用时间长，被认为是具有潜力的抗癌药物［3］，但其具体机制尚不清楚。

LOX（铜-依赖性胺氧化酶）在低氧诱导的肿瘤转移微环境中扮演着启动开关的重要作用［4-5］。上调LOX表达，可促进癌细胞转移［6］。

因此，本研究将通过人胃癌细胞AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜细胞GES-1的体外培养及相关实验，检测DS对人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移变化及DS对人胃癌细胞（BGC-823）LOX表达的影响。旨在明确DS对胃癌细胞转移过程中增殖、侵袭、迁移的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1人胃癌细胞株本研究所用的人低分化胃腺癌细胞株（BGC-823）购自于北京金紫晶生物医药技术有限公司。高分化胃腺癌细胞株AGS、未分化胃腺癌细胞株MGC-803，中分化淋巴结转移的胃腺癌细胞株SGC-7901及正常胃黏膜上皮细胞GES-1，均受赠于上海华东师范大学生命科学实验室。

1.2实验用药品DS分子量约500 000，购自于美国Sigma公司。

1.3细胞培养将5种细胞培养于无菌恒温培养箱37℃、5%CO2的完全培养基中，培养至对数生长期，传代于60 mm培养皿中，于对照组及实验组分别加入PBS及DS（终浓度为0.3%），不同时间后，收集细胞备检，将部分BGC-823细胞放置于低氧培养箱，37 ℃，5%CO2，1%O2，培养不同时间后，收集细胞备检。

1.4CCK8法检测细胞的增殖调整细胞悬液密度为2.5×104个/mL，以 200 μL/孔 接种于 96 孔板，将6个96孔板置于培养箱中培养。待细胞贴壁稳定后，换液，实验组加入含0.3%DS的培养液，对照组加入含等量PBS的培养液。0、6、12、24、36、48 h 后，每个孔内加入10 μL CCK8液，放回培养箱继续培养4 h，酶标仪450 nm处检测各孔吸光度（OD）值，每组取5个复孔平均值。

1.5Transwell细胞侵袭实验上室提前铺Matrigel胶，待凝胶凝固后，调整细胞密度至1×105/mL，取细胞悬液200 μL加入上室，在24孔板下室，实验组加入500 μL含FBS和3%DS的培养基，对照组加入含FBS和PBS的培养液，放入培养箱常规培养24 h。吸走上室内的旧培养液，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，将侵袭穿过膜的细胞进行固定和结晶紫染色，取5～10个视野进行细胞计数，取平均值。

1.6Transwell细胞迁移实验调整细胞密度至1×105/mL。取细胞悬液200 μL加入上室，24孔板下室，实验组加入500 μL含FBS和3%DS的培养基，对照组加入含FBS和PBS的培养液，放入培养箱常规培养24 h。吸走上室内的旧培养液，用棉签擦去上室内的细胞，将迁移过膜的细胞进行固定和结晶紫染色，取5～10个视野进行细胞计数，取平均值。

1.7细胞免疫化学染色将细胞爬片4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，Triton 20 min，双氧水15 min，封闭血清20 min，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，封固。LOX于细胞核表达，观察阳性细胞分布特点及变化。应用IPP图像自动分析系统，在400倍镜下，选定空白区定标，选定具有代表性的5个视野，测定光密度值，并进行计算，以获得所选视野的平均光密度值（optical density，OD）。

1.8Western-blot检测LOX蛋白的表达将BGC823细胞培养至不同时间点，冰PBS冲洗3次，加入细胞裂解液，刮下皿底细胞，在冰上充分裂解30 min，12 000 r/min 4℃离心机离心15 min，取上清。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。等量蛋白（50～200 μg）上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（8%～10%），湿转电泳转移蛋白于硝酸纤维素膜上。10%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，相应抗体4度孵育过夜。二抗孵育室温1 h，ECL化学发光试剂显色1 min，Amersham Imager 600仪器曝光。并使用Quantity one进行半定量检测，目的/内参表示相应蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 CCK8检测DS对5种细胞的增殖影响5种细胞共检测了6个时间点，0、6、12、24、36、48 h，结果显示，AGS细胞在24 h（P＜ 0.05，21.1%），36 h（P＜0.01，15.4%），48 h（P＜0.05，7.5%）实验组细胞明显比对照组减少，差异有统计学意义；SGC-7901细胞，直到 36 h（P＜ 0.05，20%），48 h（P＜0.05，19.5%）出现了DS抑制细胞增殖的显著差异；BGC-823细胞，在36 h，DS明显减小了细胞的数量（P＜0.05，18.8%）；MGC-803细胞和GES-1细胞，实验组与对照组在0、6、12、24、36、48 h差异均无统计学意义（图1）。

图1 5种细胞CCK8检测细胞增殖的统计折线图Fig.1 CCK-8 assays to detect five kinds of cells proliferation

2.2Transwell细胞侵袭实验检测DS对5种细胞侵袭力的影响在Matrigel胶上接种5种细胞24 h后，胃癌细胞株BGC-823（P＜ 0.01）、MGC-803（P＜0.01）、SGC-7901（P＜ 0.01）的穿膜细胞数明显比GES-1多，且差异有统计学意义，而胃癌细胞株AGS与正常胃黏膜细胞GES-1的穿膜细胞数均比较少，两者无明显差别，对照组平均穿膜细胞数最多的胃癌细胞是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901、AGS；相比对照组，实验组DS明显减少了5种细胞的穿膜细胞数，差异有统计学意义，且对BGC-823细胞（抑制率95%，P＜0.01）的侵袭抑制作用最明显，其次是AGS（92.8%，P＜ 0.01）、MGC-803（90.1%，P＜ 0.01）、SGC-7901（87.8%，P＜ 0.01）、GES-1（72.3%，P＜ 0.01）（图2）。

图2 Tranwell侵袭和迁移实验统计穿膜细胞数Fig.2 Tranwell cell invasion and migration assays detect invasion and transfer ability of these cells

2.3Transwell细胞迁移实验检测DS对5种细胞迁移力的影响在Transwell膜上生长24 h后，胃癌细胞株AGS（P＜ 0.05）、BGC-823（P＜ 0.05）、MGC-803（P＜ 0.01）、SGC-7901（P＜ 0.01）的穿膜细胞数均明显比GES-1多，差异有统计学意义；对照组平均穿膜细胞数最多的胃癌细胞是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901、AGS；相比对照组，实验组DS明显减少了5种细胞的穿膜细胞数，差异有统计学意义，且对AGS细胞（抑制率96%，P＜0.01）的迁移抑制作用最明显，其次是SGC-7901（94.1%，P＜ 0.01）、MGC-803（91.2%，P＜ 0.01）、BGC-823（90.5%，P＜ 0.01）、GES-1（84.3%，P＜0.01）（图2）。

2.4免疫细胞化学检测不同时间点LOX的表达随着缺氧时间的延长，对照组LOX表达量呈增加的趋势，实验组DS能够显著降低LOX的表达水平。与对照组相比，结果差异存在统计学意义，2 h（P＞ 0.05），8 h（P＜ 0.05），12 h（P＜ 0.01），24 h（P＜ 0.01）（图3）。

图3 免疫细胞化学观察BGC-823细胞不同时间点LOX的表达变化Fig.3 Immunocytochemistry detection of LOX expression at different time points

2.5Western blotting检测LOX的蛋白表达在低氧条件下，对照组中LOX蛋白表达随着时间的延长呈增加趋势，而DS能够显著降低LOX表达量。与对照组相比，结果显示部分差异具有统计学意义（8、12、24 h，P＜ 0.05；2 hP＞ 0.05）（图4）。

图4 Western blotting检测LOX的蛋白表达Fig.4 Western blotting detecting LOX protein expression

3 讨论

胃癌发生发展过程中极易发生侵袭和转移，并且分化程度不同的瘤细胞可能有不同的增殖和侵袭迁移能力，因此如何防治和治疗胃癌的增殖、侵袭和转移是目前亟需解决的问题。

不同分化程度的瘤细胞可能有着不同的增殖能力。有体外研究表明DS可抑制癌细胞的细胞黏附性、细胞周期进展和基因表达［7］。本研究采用不同分化程度的人胃癌细胞株AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜细胞株GES-1进行实验，检测DS对其增殖的影响。本研究通过CCK8增殖检测结果显示，在6、12 h DS对5种细胞的增殖均无明显抑制作用；在24 h检测出DS抑制AGS 21.1%；在36 h DS减少AGS 15.4%，SGC-7901 20%和BGC-823 18.8%，在48 h DS抑制AGS 7.5%和SGC-7901 19.5%，48 h内DS对MGC-803一直无明显抑制作用，表明DS对高分化胃癌细胞AGS的增殖抑制作用最早，且最强，而DS对未分化胃癌细胞MGC-803无明显增殖抑制作用。推测DS对胃癌细胞的增殖抑制作用可能与分化程度有关。

分化程度不同的瘤细胞具有不同的迁移能力。有研究证明，胃癌细胞BGC-823侵袭能力明显强于胃癌细胞株AGS、SGC-7901及人胚胃上皮细胞 GES-1［8］。本研究 Transwell细胞迁移实验结果显示，AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901的穿膜细胞数明显比GES-1多，可见这4种胃癌细胞的迁移能力都比正常胃黏膜细胞强。胃癌细胞中平均穿膜细胞数最多的是未分化胃癌细胞MGC-803，然后依次是低分化胃癌细胞BGC-823、中分化胃癌细胞SGC-7901、高分化胃癌细胞AGS，可见分化程度越低，穿膜细胞数越多，细胞迁移力越强；与对照组相比，DS明显减少了实验组5种细胞的穿膜细胞数，且对高分化胃癌细胞株AGS细胞的迁移抑制作用最明显，其次是SGC-7901、MGC-803、BGC-823和正常胃黏膜细胞GES-1。由此推测，DS可能对5种细胞株的迁移能力均有抑制作用，并且与分化程度有关。

不同分化程度的瘤细胞具有不同的侵袭能力。本研究侵袭实验结果显示，胃癌细胞中平均穿膜细胞数最多的是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901和AGS，可见分化程度越低穿膜细胞数越多，可能是因为细胞分化程度越低，其侵袭力越强，降解细胞外基质穿过基质胶的能力越强；相比对照组，DS明显减少了实验组5种细胞的穿膜细胞数，且对BGC-823细胞的侵袭抑制作用最明显，其次是 AGS、MGC-803、SGC-7901、GES-1。本研究表明，DS对5种细胞侵袭过程的抑制强度顺序与抑制迁移的顺序不同，也与细胞分化程度无明显关系。有研究表明［9］，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶是降解基底膜和间质的主要成分，还有一种非蛋白酶依赖性的变形运动和膜泡运动的转移方式。DS对5种细胞的侵袭和迁移的抑制强度顺序不同，可能是因为缺氧环境下几种细胞分泌基质金属蛋白酶、降解细胞外基质的能力不同，并且DS可能对几种细胞分泌的基质金属蛋白酶有不同程度的抑制作用，具体抑制程度尚需要进一步研究。

课题组前期曾研究表明DS可以调节人胃癌细胞BGC-823 HIF-1α的蛋白表达，其可能会通过下调HIF-1α的表达从而抑制人胃癌细胞大网膜种植转移［10］。而LOX被认为是受HIF调控的，是HIF-1的直接靶点之一，其在迁移和黏附的功能上需要缺氧诱导而发生［11］。LOX在低氧诱导的转移过程中主要作用表现在细胞定位、细胞类型和转化状态，在肿瘤微环境中扮演着启动开关转移的重要作用［12］。研究证明，LOX活性是由氧含量进行调节的，并且LOX能够调节细胞的迁移和黏附能力［13］。于是本研究进行了DS对胃癌细胞中LOX表达的影响。本实验在低氧条件下表明，对照组LOX蛋白表达随时间延长升高，实验组应用DS后能显著降低LOX表达水平，表明DS可能通过影响LOX表达抑制人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移，但其机制可能与HIF-1α有关系，还需进一步研究。