亚慢性染铝致大鼠肝脏结构的影响

赵汉嵩，陈明生，李艳飞

(1.山东省诸城市畜牧兽医管理局，山东 诸城 262200；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

铝是自然界中含量非常丰富的一种金属元素，因其优良的特性而被广泛使用[1]。近年来，随着现代工业和医学的发展，各种铝制物品和含铝药物被广泛使用，通过食物、饮水、空气、药物进入人体的铝量大大增加。大量动物试验证实，长期铝暴露可在动物机体肝、肾、脑、骨、肺等 器官中大量蓄积[2]。肝脏是机体最大的腺体，是外来化学物代谢和生物转化的最主要的器官，因此也是最易遭受损害的器官。有研究表明，进入动物体内的铝能够很快在肝脏内蓄积并且抑制肝脏正常功能[3]，而肝细胞是肝脏的基本功能单位，进入机体的铝是否通过损伤肝脏细胞从而影响肝脏功能，其机理尚不清楚。为了深入研究铝暴露对肝脏的损伤作用并提供切实可靠的参考性指标，本研究通过饮水建立亚慢性铝暴露大鼠模型，通过对肝脏显微及超微结构的检测，旨在揭示铝对大鼠肝脏结构的影响，为揭示铝毒害作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 99%(质量纯度)结晶三氯化铝，为国产分析纯。Leica DM2000显微镜(德国徕卡公司)；GEM-1200ES型透射电子显微镜(日本电子公司)；德国菜卡2135型切片机(德国莱卡公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物和处理 48只4周龄清洁级Wistar大鼠，预饲喂一周，随机均分为四组，分别于饮水中添加 0，64.18，128.36，256.72 mg/kg·bw AlCl3·6H2O溶液，分为对照组(C组)和低(L组)、中(M组)、高剂量(H组)染铝组。各组大鼠自由采食饮水，试验期为120 d。

1.3 检测项目和方法

1.3.1 肝脏显微检测 试验结束后，断头处死大鼠，用刀片迅速选取5 mm×5 mm×3 mm大小的肝脏组织固定于10%福尔马林磷酸盐缓冲液中，经固定72 h后，常规石蜡包埋，切片，切片厚6 μm，经二甲苯两次各10 min；无水酒精两次各10 min；90%、80%、70%酒精各5 min，蒸馏水浸5 min；苏木素染色8 min，自来水冲洗；含1%盐酸的70%酒精中分化20 s，蒸馏水浸5 min；70%、80%酒精各5 min；90%伊红醇溶液中10 min；无水酒精两次各5 min；二甲苯两次各5 min；中性树胶封片，显微镜下观察，拍照并记录。

1.3.2 肝脏细胞超微检测 固定：大鼠剖杀后，用刀片迅速选取快速取肝脏组织，在3%戊二醛固定液中修成大约1.5 mm×1.5 mm×2 mm小块；置于磷酸缓冲液(PBS，pH值7.4)配置的3%戊二醛中固定1周，4 ℃下保存。浸洗与后固定：用0.1 mol/L PBS浸洗3次，每次10 min，再用1%锇酸后固定2 h。浸洗与脱水：用0.1 mol/L PBS浸洗3次，每次10 min。酒精梯度脱水：30%、50%、70%、90%酒精，每级15 min，100%酒精两次，每次15 min。最后换成100%丙酮15 min。浸透：将脱水组织逐级渗透，在低浓度包埋剂(100%丙酮:Epon812=2∶1)中浸透30 min，并分别在中浓度(1∶1)和高浓度(1∶2)包埋剂中浸透1 h和2 h。2 h后打开瓶盖，浸透过夜。包埋：将写好的标签装入胶囊，以牙签将组织块送入胶囊底中央，注入包埋剂，将包埋好的胶囊置于包埋膜具上，放恒温箱中梯度聚合，置37 ℃、45 ℃、60 ℃下分别放置17 h、24 h、17 h。超薄切片及染色：半薄切片定位后进行超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜观察，拍照并记录。

2 结果

2.1 大鼠肝脏显微结构检测结果 中插彩版图1至图4为大鼠肝脏显微结构病理变化，C组大鼠肝脏肝小叶结构完整，肝细胞索走向正常。肝细胞呈多边形，结构完好，排列紧密，细胞和细胞核轮廓清晰，核膜完整，细胞核大而圆，核染色质稀疏淡染，核仁清晰，细胞质丰富，多呈嗜酸性(中插彩版图1)；L组大鼠肝细胞排列比较规整，部分肝细胞溶解，细胞界限不清，部分细胞核固缩，散在炎性细胞(中插彩版图2)；M组肝脏细胞排列紊乱，细胞界限不清，肝细胞核溶解(中插彩版图3)；H组肝脏细胞排列紊乱，溶解，界限不清，小叶结构消失，细胞核固缩、碎裂或溶解(中插彩版图4)。

2.2 大鼠肝脏超微结构检测结果 图5至图8为大鼠肝脏超微结构病理变化，对照组肝细胞胞浆丰富，核膜完整，核圆，核仁清晰，染色质均匀分布，细胞内可见丰富的线粒体及粗面内质网，线粒体大小均匀，结构清晰，基质丰富，呈板层分布(图5)，内质网上富含核糖体，周围胞浆内可见大量糖原颗粒，高尔基体清晰可见(图6)。染铝组大鼠肝细胞核形态异常，核皱缩，核膜内陷，细胞质内细胞器相对减少，溶酶体增多，脂滴增多，粗面内质网减少(图7)，线粒体肿胀、变圆，排列紊乱，板层减少，线粒体嵴模糊甚至消失，粗面内质网减少并脱颗粒，溶酶体增生(图8)。

3 讨论

铝对大鼠肝脏结构的影响 肝脏是动物体内新陈代谢的重要器官，在糖、蛋白质、脂肪、维生素和激素的代谢中发挥着重要作用，而且还具有分泌、排泄和生物转化等功能。正常情况下，肝脏的各种代谢反应相互配合有条不紊的进行。肝脏又是一个脆弱的器官，当其受到体内外各种因素的侵害时，肝脏结构和功能将受到不同程度的损害，进而引起相应的代谢紊乱。铝在肝脏内蓄积，可导致肝脏发生病理改变，肝细胞内线粒体出现嵴断裂、溶解、崩溃；长期服用铝营养液的病人，可发生胆汁郁积性肝病，肝细胞发生病理学改变[4]。研究发现，染铝组小鼠肝脏中央静脉周围肝细胞表现出水肿，细胞核溶解，肝血窦扩张充血，肝细胞条索排列紊乱[5]。肝脏病理变化是评价肝损伤的客观指标。

图5 对照组肝脏电镜 (×4 200)

图6 对照组肝脏电镜 (×11 500)a：核糖体； b：糖原颗粒： c：高尔基体

图7 染铝组肝脏电镜 (×2 550)a：核皱缩； b：溶酶体； c：脂滴

图8 染铝组肝脏电镜 (×11 500)a： 线粒体

本试验发现，对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞索走向正常，中央静脉周围的肝细胞索和肝血窦呈放射状排列。肝细胞呈多边形，结构完好，排列紧密，细胞和细胞核轮廓清晰，核膜完整，细胞核大而圆，核染色质稀疏淡染，核仁清晰，细胞质丰富；肝脏超微结构观察可知，肝细胞胞浆丰富，染色质均匀分布，细胞内可见丰富的线粒体及粗面内质网，线粒体大小均匀，结构清晰，基质丰富，呈板层分布，内质网上富含核糖体，周围胞浆内可见大量糖原颗粒，高尔基体清晰可见。而染铝组大鼠随着染毒剂量的增加，大鼠肝脏体积明显缩小，与周围组织粘连，肝小叶结构消失，肝脏细胞排列紊乱，部分肝细胞溶解，细胞界限不清，肝血窦中散在大量红细胞，散在炎性细胞，肝细胞核固缩、碎裂或溶解，超微结构观察可知肝细胞核形态异常，核皱缩，核膜内陷，细胞质内细胞器相对减少，溶酶体增多，脂滴增多，粗面内质网减少，线粒体肿胀、变圆，排列紊乱，板层减少，线粒体嵴模糊甚至消失，粗面内质网减少并脱颗粒，溶酶体增生。

综上所述，长期染铝对肝细胞具有毒性作用，导致肝细胞发生组织形态学和超微结构改变，损伤肝脏结构，进而导致肝脏损伤，损害肝脏功能。