维甲酸致小鼠高转换型骨质疏松模型建立及量效关系探讨

樊雪妮，周 旋，蔡文卓，许明祥，王兆卫，蔡 瑜，林 丽，郗艳丽

(吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132013)

骨质疏松症(OP)是一种以骨量减少和骨组织的微结构破坏为主要特征的一种代谢性疾病，严重者会导致骨的脆性增加且易发生骨折[1]。骨质疏松症是一种与年龄增加有关的骨骼疾病，是机体自然衰退和老化的结果[2]。据不完全统计，2006年我国骨质疏松症患者近7 000万，骨量减少者超过2亿人[3]。尽管缺乏最新的流行病学数据，但随着我国人口老龄化问题日趋严峻，估测我国骨质疏松症和骨量减少人数将远超过7 000万。骨质疏松症已成为我国面临的重要公共卫生问题，引起了人们的高度重视[4]。骨质疏松动物模型是研究骨质疏松症发病机理和抗骨质疏松症药物作用机制的重要依据。维甲酸(Retinoic acid)是维生素A的衍生物，主要用于皮肤科疾病的治疗，伴有骨质疏松的不良副作用[5]。研究发现，维甲酸对骨代谢有显著影响[6]，利用维甲酸构建的骨质疏松模型在发病症状、骨组织学形态以及对雌激素的骨反应等各个方面，均与人类骨质疏松有着极高的相似性[7]。但多数研究使用了大鼠构建模型，少有人用小鼠构建骨质疏松模型。在药物机制探讨过程中，小鼠易于大量饲养且成本较大鼠低。因此，本研究利用维甲酸的特性，构建小鼠骨质疏松模型，为抗骨质疏松症药物筛选和基础研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雌性ICR小鼠40只，体重(384)g，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号SCXK(吉)-2016-0003。饲养于吉林医药学院实验动物中心，许可证号：SYXK(吉)-2012-0004，温度18 ℃～22 ℃，相对湿度45%～65%，明暗交替。普通饲料喂养，自由饮水。普通饲料，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2015-0005。本研究所涉及的动物相关操作均在吉林医药学院动物伦理委员会批准下进行。

1.2 药物及试剂 维甲酸(美国Ark Pharm公司，货号AK-73126)；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、降钙素(Calcitonin, CT)、骨钙素(Osteocalcin, OCN)、骨源性碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase, BALP)，钙(Calcium, Ca)和磷(Phosphorus, P)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20161116、20160810、20160810、20160810、20160829、20160808)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0332)；苏木素染液和水性伊红染液(美国Sigma公司，货号分别为H9627和E4009)。

1.3 仪器 Synergy H1M酶标仪(美国BioTek公司)；YLS-16A小动物骨骼强度测定仪(成都泰萌软件有限公司)；EG1150生物组织包埋机(德国Leica公司)；RM2245病理切片机(德国Leica公司)；NIU普通光学显微镜(日本尼康公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 将购得的40只ICR雌性小鼠在实验室适应生长7 d后，按体重分为对照组、维甲酸低剂量组、维甲酸中剂量组以及维甲酸高剂量组，每组10只。对照组给予0.5 g/kg·bw生理盐水灌胃；低、中和高3个剂量组分别依次给予67.2 mg/kg·bw、84.0 mg/kg·bw和102.0 mg/kg·bw的维甲酸溶液灌胃。每天上午给药，连续灌胃14 d，每天测量体重、饮水量和摄食量。

1.4.2 样本采集 末次给药24 h后眼球取血，分离血清并测定血清中Ca、p、CT、OCN、BALP和TRAP水平。迅速剖取小鼠脏器并摘取小鼠左侧股骨，放入Jenkin脱钙液脱钙60 h，4%多聚甲醛溶液中固定。摘取右侧股骨备用。

1.4.3 苏木素-伊红(H.E.染色)观察病理形态 固定的股骨组织自来水冲洗，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡，包埋，切片。石蜡切片脱蜡至水，苏木素染液染细胞核，分化液分化，氨水返蓝，伊红染色液复染细胞质，快速脱水，透明后中性树脂封片，镜检。

1.4.4 骨骼强度测量 取小鼠右侧股骨，称重后置于骨骼强度测定仪中测定小鼠股骨强度。

1.4.5血清中Ca、p、CT、OCN、BALP和TRAP水平测定 按试剂盒说明书方法，测定血清中Ca、p、CT、OCN、BALP和TRAP水平。

2 结果

2.1 维甲酸对小鼠一般状况的影响 随着维甲酸灌胃时间的延长，各剂量组小鼠均出现不同程度的体质量减轻，而食物摄入量逐渐增加，但各剂量组小鼠日均食物摄入量变化不如日均体质量变化明显。各剂量组小鼠终末体质量显著低于对照组(P<0.01)。与初始体质量比较，各剂量组小鼠终末体质量显著降低(P<0.05)，而对照组小鼠终末体质量虽然高于初始体质量，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1A和1B。维甲酸灌胃后，有的小鼠出现竖毛、喜卧等表现。通过对各组小鼠饮水量的比较发现，各组小鼠日均饮水量没有明显差异(图1C)。

图1 各组小鼠体重、食物摄入量和水摄入量的变化情况

A：各组小鼠体重变化； B：各组小鼠食物摄入量变化； C：各组小鼠水摄入量变化。与对照组相比，*:P<0.05，**P<0.01；与初始体质量相比，#:P<0.05

2.2 维甲酸对小鼠脏器系数的影响 由表1可知，与对照组比较，各剂量组小鼠脏器系数均有不同程度的增加。其中维甲酸低剂量组小鼠肝脏组织脏器系数显著增加(P<0.01)；维甲酸中剂量组小鼠肝脏组织脏器系数显著增加(P<0.01)，此外，脾组织脏器系数也显著增加(P<0.05)；维甲酸高剂量组小鼠脾和肾脏组织脏器系数显著增加(P<0.05)，而心脏和肝脏脏器系数增加得最明显(P<0.01)。低、中剂量和高剂量维甲酸组小鼠脏器系数之间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

组别心肝脾肺肾对照组0.49±0.063.86±1.550.46±0.140.74±0.211.10±0.12低剂量组0.55±0.085.13±0.71∗∗0.60±0.150.84±0.231.21±0.21中剂量组0.55±0.094.94±0.48∗∗0.69±0.21∗0.88±0.171.18±0.14高剂量组 0.59±0.11∗∗5.11±0.87∗∗ 0.64±0.18∗ 0.86±0.15 1.29±0.15∗

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 维甲酸对小鼠血清中Ca、P和CT的影响 由表2可知，随着维甲酸灌胃剂量的增加，各剂量组小鼠血清中Ca和P水平逐渐升高，而CT水平逐渐降低。与对照组比较，低剂量维甲酸组小鼠血清中CT水平显著降低(P<0.01)；中剂量和高剂量维甲酸组小鼠血清P水平显著升高(P<0.01)，CT水平显著降低(P<0.01)。高剂量维甲酸组小鼠血清P水平显著高于低剂量和中剂量维甲酸组(P<0.01，P<0.05)。

组别Ca/ (mmol/L)P/(mmol/L)CT/(ng/L)对照组1.27±0.162.32±0.19144.80±16.04低剂量组1.26±0.212.73±0.18126.56±7.38∗∗中剂量组1.28±0.213.12±0.66∗∗124.36±4.84∗∗高剂量组1.31±0.253.56±0.59∗∗##▼121.86±8.08∗∗

注：与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01；与低剂量组相比，#P<0.05,##P<0.01；与中剂量组相比，▼P<0.05,▼▼P<0.05，下表同

2.4 维甲酸对小鼠血清中TRAP、BALP和OCN的影响 由表3可知，随着维甲酸灌胃剂量的增加，各剂量组小鼠血清中TRAP、BALP和OCN水平逐渐升高。与对照组比较，低剂量维甲酸组小鼠血清中TRAP水平显著升高(P<0.05)；中剂量维甲酸组小鼠血清中BALP水平升高(P<0.05)，而TRAP和OCN水平显著升高(P<0.01)；高剂量维甲酸组小鼠血清中TRAP、BALP和OCN水平显著升高(P<0.01)。中剂量维甲酸组小鼠血清中OCN水平高于低剂量维甲酸组(P<0.05)，而TRAP水平显著高于低剂量组(P<0.01)。高剂量维甲酸组小鼠血清中TRAP、BALP和OCN水平显著高于低剂量维甲酸组(P<0.01)，BALP水平高于中剂量维甲酸组(P<0.05)，而TRAP显著高于中剂量维甲酸组(P<0.01)。

组别TRAPBALPOCN对照组0.94±0.1022.41±0.696.46±0.65低剂量组1.27±0.27∗23.11±1.096.89±0.69中剂量组1.78±0.32∗∗##24.05±0.63∗8.53±1.05∗∗#高剂量组2.15±0.32∗∗##▼▼25.37±0.68∗∗##▼9.23±0.99∗∗##

2.5 维甲酸对小鼠骨质量和骨骼强度的影响 由表5可知，随着维甲酸灌胃剂量的增加，各剂量组小鼠股骨质量和股骨强度逐渐降低。低、中剂量和高剂量维甲酸组股骨质量明显低于对照组(P<0.05)，中剂量和高剂量维甲酸组小鼠股骨强度低于对照组(P<0.05)。

表4 各组小鼠股骨质量和强度变化情况

2.6 病理形态学观察 从中插彩版图2、图3可知，对照组骨皮质完整，较厚，骨髓腔内容物较多，骨骺生长活跃，骨骺内骨小梁排列规则、粗细均匀、致密，骨组织表面可见成骨细胞和少量破骨细胞。低剂量维甲酸组骨小梁较对照组细，但较中剂量和高剂量维甲酸组粗大，相互连接，排列整齐，骨髓数量多，骨组织表面成骨细胞基本正常、破骨细胞轻度增多。中剂量和高剂量维甲酸组骨皮质变薄，骨髓数量减少，骨小梁细少，较为稀疏，粗细不均，排列紊乱，骨组织表面的成骨细胞减少、破骨细胞增多。

3 讨论

随着对疾病认识的深入，构建更加科学的模型应用于研究势在必行。目前研究骨质疏松症的动物模型多使用大鼠，鲜有人使用小鼠。本试验利用在药理、毒理、食品、生物制品等科研和教学中广泛使用的ICR小鼠构建骨质疏松模型，该模型能减少药物筛选的试验成本，提高筛选效率。维甲酸是构建骨质疏松模型的常用药物，利用维甲酸造模的方法具有成功率高、造模周期短、动物骨质疏松表现典型等优点。本试验利用维甲酸灌胃后，小鼠体质量显著降低，而食物摄入量虽降低，但不明显。这一结果表明，维甲酸有毒性作用，会降低实验动物体重，这与大鼠的实验结果一致[8]。

骨质疏松会伴有骨矿溶解、骨Ca和P含量降低等典型表现，此时血清中Ca和P也会伴有显著升高。本研究发现，各剂量组小鼠血清Ca和P水平明显高于对照组，且这种升高有明显的剂量依赖关系。这一结果表明，维甲酸促进了骨代谢和骨生成。CT能抑制小肠对于钙离子的吸收，降低体内血钙浓度，使血中游离钙向骨组织中转化；与此同时，CT还有抑制破骨细胞的骨吸收作用，减少骨骼中的钙离子流失到血液中，从而降低血钙水平。本试验中随着维甲酸剂量的升高，小鼠血清中CT的含量明显降低，间接促进了骨代谢和骨吸收。

测定血清中TRAP水平可反映破骨细胞活性。在骨吸收期间，破骨细胞产生和分泌的TRAP进入破骨细胞和骨表面之间的间隙，参与了骨矿物质的降解[9]。本研究结果显示，随着维甲酸使用剂量的增加，TRAP活力逐渐升高，维甲酸与TRAP之间呈明显的剂量依赖关系，提示维甲酸能使破骨细胞活性增加，骨代谢活跃，骨转换率升高，促进了骨吸收。BALP是反映骨形成的特异指标。研究发现，骨质疏松所致骨折发生时，静止的成骨细胞会转变成活跃的成骨细胞，进而出现骨吸收亢进，而BALP水平也相应升高[10]。本研究发现，随着维甲酸使用剂量的增加，BALP活性也随之增加，呈明显的剂量依赖关系。提示维甲酸作用后，成骨细胞活性增强，导致骨吸收大于骨形成，此时骨组织出现了高转换状态。OCN是反映骨更新情况的特异性生化指标。OCN水平越高，骨更新越快。OCN水平升高常见于高转换型骨质疏松症。本研究发现，OCN随着维甲酸的剂量增高而明显升高，提示维甲酸能增加骨转换率。结合上述结果发现，维甲酸诱导的小鼠骨质疏松模型是高转换型。

骨强度测量是诊断骨质疏松症的重要客观指标，骨密度和骨质量两个方面能有效反映骨强度。本研究发现，给予维甲酸后，小鼠股骨质量和骨强度显著低于对照组，呈显著的剂量依赖关系。这表明维甲酸可能通过影响骨骼密度的方式降低骨骼强度。H.E.染色观察可见，维甲酸组皮质骨面积降低，骨小梁变稀疏且松散，数目减少。对照组骨皮质面积正常，骨小梁密集且交织成网。这一结果进一步论证了维甲酸作用后，降低了小鼠骨骼密度，进而降低了骨骼的强度，这可能是骨质疏松症患者容易发生骨折的原因。

综上所述，本研究利用维甲酸对雌性小鼠诱导，成功构建小鼠高转换型骨质疏松模型。此外，利用维甲酸构建的小鼠骨质疏松模型有较好的量效关系，但低剂量维甲酸所致骨质疏松的效果较差，从经济的角度来看，中剂量所致骨质疏松模型比较合理，可应用于药物的筛选和骨质疏松症发病机制的探讨。