乳房炎奶牛血液中TNF-α、IL-1β及其mRNA表达水平的研究

杨丽华，韩一超，邱建东，董春光，韩文儒，刘文俊，陈剑波，武守艳

(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032；2.太原市动物卫生监督所，山西 太原 030027)

奶牛乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化学、微生物等刺激所发生的一种炎性变化，是世界奶牛业的主要危害疾病之一。奶牛乳房炎可引起奶牛产奶量下降，牛乳品质发生改变，对奶牛危害很大，甚至危及人的健康。针对奶牛乳房炎，国内外有关人士进行了多年的研究，但到目前为止，奶牛乳房炎的发病机理、机体的变化情况尚未完全清楚。因此，研究奶牛乳房炎发病机理，寻找预防和治疗的方法仍然是兽医工作者的一个重要任务。

细胞因子是免疫系统有关细胞间相互作用的介质，它诱导、促进和调节免疫细胞活化、增殖、分化和表达，并且对机体免疫应答、免疫发生、免疫保护和免疫损伤效应的产生都具有重要作用[1]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为具有调节体内免疫功能和代谢过程的细胞因子，是机体感染炎症及免疫应答体系和一系列病理生理过程的重要介质[2]。白细胞介素-1β(IL-1β)具有广泛的生物学活性，它能诱导IL-6、TNF及其自身的分泌，并和TNF相互促进对方的释放，在炎症反应中起协同作用[3]。

目前，国内外对奶牛乳房炎研究的重点主要集中在对其致病菌的分离鉴定、奶牛乳房炎的病因探讨和治疗方面，对奶牛乳房炎血清中细胞因子水平的研究较少。本研究针对山西省规模化牛场临床型乳房炎奶牛、隐性乳房炎奶牛和健康奶牛血液中的TNF-α、IL-1β含量及其mRNA基因表达进行测定，观察乳房炎奶牛血液中上述细胞因子的变化规律及特点，旨在探讨乳房炎奶牛血液成分的变化情况与奶牛乳房炎发生发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择分组 随机选取经产2～5胎、营养中等、处于泌乳期且患有临床型乳房炎(无其他临床疾病)的奶牛30头作为临床型乳房炎组(体细胞数>100万个/mL)；将经产2～5胎，体重、泌乳期、产奶量相近，营养中等，全身状况良好，无临床症状，乳腺及乳汁无肉眼可见的临床症状的隐性乳房炎奶牛30头作为隐性乳房炎组(50万个/mL <体细胞数<100万个/mL)；符合上述要求的阴性奶牛30头作为健康组(体细胞数<50万个/mL)[4]。

1.2 血样的采集与处理 试验奶牛早晨饲喂前，用一次性使用静脉血样负压采集管于被测奶牛颈静脉处无菌采集抗凝血和非抗凝血。非抗凝血冰盒内静置，待凝血后以3 000 r/min(4 ℃)离心15 min，分离血清，分装于1.5 mL EP离心管中，放入 -20 ℃ 冰箱保存，用于血液细胞因子的检测。抗凝血分离外周血单核细胞(PBMC)(具体方法详见牛外周血淋巴细胞分离液KIT说明书)，在PBMC中加入TRIZol裂解液，裂解细胞后放入液氮中，然后转移至-80 ℃冰箱保存，用于总RNA的提取。

1.3 ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β的含量[5]检测血清中TNF-α、IL-1β含量按照牛肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒说明书操作步骤进行。

1.4 乳房炎奶牛PBMC中细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表达量的测定 采用实时荧光定量PCR进行分析。用TRIZol方法提取PBMC总RNA。将置于-80 ℃冰箱冻存的PBMC细胞TRIZol裂解液取出在室温下溶化，每1 mL TRIZol液加0.2 mL氯仿，在漩涡振荡器上振荡充分混匀，室温静置3 min，12 000 r/min(4 ℃)离心15 min。吸取上清液，转移至另一EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混合均匀后室温放置10 min。12 000 r/min(4 ℃)离心10 min，弃上清。加入1 mL预冷的冰乙醇(70%)洗涤沉淀总RNA，10 500 r/min(4 ℃)离心10 min。此步骤可重复1～2次。弃去70%乙醇，经干燥后，加入50～100 μL DEPC处理过的水，4 ℃溶解，置于-80 ℃保存或用于后续试验[6]。

采用琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的质量，Quawell Q500核酸蛋白检测仪测定RNA浓度和OD260/OD280值。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser对总RNA进行反转录。

根据NCBI公布的牛TNF-α、IL-1β和β-actin的mRNA序列，采用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用RT-PCR对引物进行验证[7]。

表1 引物序列

根据SYBR®PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)说明书，使用ABI PRISM 7 500 Real-time PCR System(ABI，USA)对TNF-α、IL-1β基因进行扩增。采用ΔΔCt法进行 qPCR 数据的处理，即在内参基因和目的基因扩增效率相同的情况下，目的基因的含量=2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt=(CtTarget-CtActin)处理组-(CtTarget-CtActin)对照组，2-ΔΔCt表示试验组目的基因与对照组的变化倍数。每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 各组试验动物体细胞数结果 本试验采用体细胞电子计数法对全场处于泌乳期的奶牛进行体细胞数检测，各组奶牛体细胞数结果见表2。结果表明，各组间奶牛体细胞数差异显著。

表2 各组奶牛体细胞数

*:P<0.05，**:P<0.01，下表同

2.2 各组奶牛血清细胞因子检测结果 由表3可以看出，由于奶牛患有乳房炎，其血清中各种细胞因子的水平均发生了不同程度的变化，尤其以临床型奶牛变化最为显著。临床型乳房炎奶牛组与健康奶牛组相比，血清中 TNF-α和IL-1β的含量均极显著的升高(P<0.01)，分别升高了89.71%、82.06%；隐性乳房炎奶牛组与健康奶牛组相比，奶牛血清中TNF-α和IL-1β的含量均显著的升高(P<0.05)，分别升高了62.31%、57.57%。

表3 各组奶牛血清中细胞因子

2.3 PBMC中TNF-α和IL-1β mRNA表达量的检测

2.3.1 PBMC总RNA的提取与检测 按照Invitrogen公司TRIZol说明书，对各个试验组样品进行总RNA的提取，用核酸浓度测定仪检测RNA的浓度和完整性，结果显示，样品的OD260/OD280值都在1.8-2.0之间，表明RNA纯度符合试验要求。取适量的RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，各样品的总RNA 28 S、18 S和5.8 S条带整齐清晰，带与带之间无拖尾现象，说明RNA比较完整，可以用于后续试验。

2.3.2 荧光定量PCR引物验证 以PBMC的cDNA为模板，各个基因相对应的特异性引物，进行普通PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。检测结果如图2所示，分别在约223 bp、104 bp和189 bp处获得单一的亮带，与预期的片段大小一致，无引物二聚体和其他非特异性条带。

图1 总RNA提取电泳图

1-3：正常牛； 4-6：疾病牛

图2 PCR产物电泳图

1：DNA Marker; 2:TNF-α; 3:IL-1β； 4:β-actin

将普通PCR产物割胶回收，纯化后的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，3个基因的扩增片段所测序列，分别与NCBI数据库核苷酸序列比对，结果显示，与NCBI上公布的相对应基因序列相似性为98%以上。

2.3.3 熔解曲线分析验证TNF-α和IL-1β熔解曲线如图3、4所示 目的基因与内参基因Tm值均一，目的基因与内参基因的熔解曲线峰值分别单一，没有引物二聚体和其他非特异性条带的干扰。

图3 目的基因TNF-α与内参基因β-actin的熔解曲线

图4 目的基因IL-1β与内参基因β-actin的熔解曲线

2.3.4 乳房炎对PBMC中TNF-α和IL-1β mRNA表达量的影响 选用最佳反应体系，在相同条件下，对正常牛和疾病牛PBMC的TNF-α和IL-1β基因的表达量进行定量，通过β-actin校正，采用2-△△Ct对目的基因的表达量进行分析。如图5所示，疾病牛与正常牛相比较，PBMC中TNF-α和IL-1β的mRNA表达量均显著升高(P<0.05)。

综上结果显示，乳房炎奶牛血液中细胞因子TNF-α、IL-1β含量及mRNA表达水平均发生了不同程度的变化，尤其以临床型奶牛变化最为显著。综合之前乳腺炎对奶牛血液常规指标及生化指标的试验结果表明，奶牛乳房炎是一个全身性的病理过程，不仅乳腺组织遭到破坏，血液成分也发生了变化。临床型乳房炎组奶牛比隐性乳房炎组奶牛血液成分变化明显。临床型乳房炎奶牛临床症状明显，感染严重，病程较长，营养不良，多项指标检测结果均与此有关。依据血液指标及其动态变化情况，不仅可以用来判断动物体内的各种生理活动和新陈代谢是否正常，也可以对兽医工作者进行临床诊断和治疗提供重要的参考依据。

图5 乳房炎对PBMC中TNF-α和IL-1β mRNA表达量的影响

3 讨论

综上所述，我们对规模化奶牛场乳房炎与细胞因子的关系做了一些研究，还处于初步试验阶段，乳房炎的免疫学机制复杂，对试验结果有一定影响。确定乳房炎的特异性细胞因子还需要更全面、更深入的研究。研制出特异性细胞因子的预警手段，是下一步工作的重点。而且隐性乳房炎的诊断比较困难，研究一套全面完善的隐性乳房炎诊断方法，对于奶牛乳房炎的防治更具有临床意义。所以在临床实践中，更应该加强对隐性乳房炎组奶牛血液成分的监测，及早发现问题，尽早隔离治疗，防止疾病范围的扩大。

引起奶牛乳房炎的病原微生物繁多，常常多种微生物混合感染，总之，预防奶牛乳房炎的发生应从加强饲养管理，完善奶牛场的综合防制体系等入手，同时饲喂营养均衡的日粮，建立严格的卫生消毒制度，改善畜体环境，定期开展疫病监测[9]。提高隐性乳房炎的诊断率，并从环境卫生、饲养管理方面防制奶牛乳房炎，降低奶牛乳房炎的发病率，从而使奶牛场的经济效益随之提高。