糖尿病大鼠肾小管间质缺氧诱导因子2α表达变化及氯化钴对其影响*

程 晖 梁 伟 杨英杰 李紫燃 柳 欣

糖尿病肾脏疾病(Diabetic Kidney Disease，DKD)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症，也是糖尿病患者致死的主要原因之一[1]。DKD主要病理变化为肾小球基底膜(Glomerular Filtration Barrier，GBM)增厚，肾小球细胞外基质聚集和结节性肾小球硬化[2]，还包括肾小管间质损伤，并认为肾小管间质病变是慢性肾脏病预后不良的独立危险因素[3, 4]。

慢性缺氧能诱导肾小管及其间质病变，但机制尚不明确，有研究报道机体缺氧时各组织器官会表达低氧诱导因子(Hypoxia-inducible Factor，HIF)，诱导缺氧因子转录,参与细胞低氧应答[5], 其水平变化主要取决于降解速度。HIF由α(1α、2α、3α)亚基和β亚基组成，其中α亚基为调节亚基[6]。HIF部分功能已较明确，如能调节促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)表达而改善贫血[7]。DKD病人通常也会合并贫血，使机体处于慢性缺氧状态[8]。该状态的HIF-1α和肾脏功能变化已见诸报道[9]。而HIF-2α此时在肾组织尤其在肾小管间质的表达情况及对干预糖尿病进展，保护肾功能的作用，所见报道较少。因此，本研究通过制备链脲佐菌素(STZ)2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，观察HIF-2α在肾组织及小管间质的表达变化以及同时出现的肾脏间质纤维化、细胞凋亡和EPO水平等的变化，以及HIF降解抑制剂氯化钴(CoCl2)对上述变化的干预作用，为临床进一步探讨DKD治疗新策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

6周龄雄性SPF级Wistar大鼠(购自湖北省预防医学科学院实验动物中心)，体重180-200g。STZ购自美国Sigma公司；水合氯醛和柠檬酸盐溶液购自上海国药公司；兔抗小鼠HIF-2α多克隆抗体购自美国Alpha Diagnostic公司；鼠抗actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；HRP-山羊抗兔IgG抗体、HRP-兔抗小鼠IgG抗体、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国PIERCE公司；PMSF购自美国Amersco公司；Cocktail tablet购自瑞士Roche公司；光学显微镜购自日本OLYMPUS公司；稳态型血糖仪及血糖试纸购自美国强生公司；低温高速离心机购自美国Beckman公司；Western blot电泳槽、电转槽购自美国Bio-red公司。

1.2 复制T2DM模型及分组处理

24只大鼠按数字随机化原则分为实验组16只和对照组(CON组8只)。实验组每只大鼠均一次性腹腔注射2% STZ溶液2ml(将40mg STZ粉溶于2ml 0.1mol/l柠檬酸盐缓冲液中，将pH调至4.5)诱发T2DM模型，对照组腹腔注射等量柠檬酸盐溶液。72h后取大鼠尾静脉血测血糖，以血糖≥16.7mmol/L确定为T2DM大鼠[10]。16只实验室大鼠均成模。将实验组大鼠随机分为DM组及DM+ CoCl2组(各8只)，DM+ CoCl2组采用含0.2mM CoCl2溶液作为饮水进行干预治疗，每只大鼠平均每天摄入1mg CoCl2[11]，DM组和CON组用生理盐水替代，共24周。

1.3 检测指标和方法

CoCl2干预结束后，用10%水合氯醛按腹腔注射(300mg/kg)麻醉各组大鼠，剖腹后立即分离肾脏，用4%多聚甲醛固定，常规方法石蜡包埋切片，进行以下指标检测。

1.3.1 免疫组化法检测HIF-2α表达：将石蜡切片脱蜡入水，PBS洗5min×3次；用pH 6.0 柠檬酸盐缓冲液微波修复10min，PBS洗5min×3次；用3%H2O2孵育20min，PBS洗5min×3次；5% BSA封闭30min，甩去BSA后加入对应一抗(HIF-2α多克隆抗体)，4℃过夜，PBS清洗5min×3次；加入对应二抗，于37℃湿盒中孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加SP免疫组化试剂，37℃湿盒中孵育30min，PBS洗5min×3次；DAB显色、苏木素复染；HIF-2α阳性为棕色，用Image-pro plus 6.0图像分析软件(美国Media cybernetics公司开发)分析，呈色反应平均积分光密度(Mean IOD)值越大，HIF-2α表达越多。

1.3.2 PAS染色观察肾组织病变及肾小球硬化指数(GSI)和间质纤维化指数(IF)评分:取肾组织石蜡切片按常规方法进行PAS染色，观察以下病变：(1)系膜细胞增殖；(2)系膜外基质增多；(3)肾小球节段或全球硬化；(4)间质炎性细胞浸润；(5)肾小管萎缩，细胞外基质增多；(6)蛋白管型。用GSI和IF分别分析肾小球和小管间质病变程度。0分，肾小球和小管间质未见上述病理改变；1分，病变面积<25%，2分，病变面积25%—50%；3分，病变面积50%—75%；4分，病变面积>75%。每张切片分析30个肾小球和20个无肾小球低倍镜视野。

1.3.3 TUNEL法检测细胞凋亡：将石蜡切片脱蜡入水，PBS洗5min×3次；蛋白酶K消化15min，PBS洗5min×3次；3%H2O2阻断30min，PBS洗5min×3次；加入末端核苷酸转移酶和生物素标记脱氧三磷酸尿苷，37℃湿盒内反应1h，PBS洗5min×3次；加入卵白素标记的HRP，在37℃湿盒中反应30min，PBS洗5min×3次；DAB显色，苏木素复染；脱水透明，封片，高倍镜(×200)下观察。胞核呈棕黄色染色者为凋亡细胞。细胞凋亡率=凋亡细胞数/有核细胞总数×100%。每张切片观察30个随机视野。

1.3.4 免疫印迹法检测EPO表达:用RIPA裂解液裂解肾皮质，4℃、13000g离心10min，取上清，BCA法测定蛋白质浓度，取20μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1h，孵育对应一抗，4℃过夜，TBST洗5min×3次，加入对应HRP标记的二抗，室温孵育1h，TBST洗5min×3次，ECL化学发光试剂显色，X光胶片曝光、显影、定影、凝胶成像分析系统行各电泳条带光密度(OD)扫描,采用EPO和β-actin的OD比值表示EPO相对表达量，比值越大，表达水平越高。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠肾小管间质HIF-2α表达

CON组大鼠肾组织无明显HIF-2α表达，DM组大鼠肾组织肾小管间质见散在HIF-2α表达,DM+CoCl2组HIF-2α表达更多(图中棕色区域所示)。Mean IOD比较，DM组较CON组明显增加(0.436±0.106 vs 0.013±0.001，t=3.253，P<0.01)，DM+CoCl2组又较DM组显著增加(1.472±0.284 vs 0.436±0.106，t=3.971，P<0.01)。见图1。

图1 各组肾组织间质HIF-2α表达(SP法, ×200)

2.2 各组肾脏病变及肾小球硬化、肾小管纤维化程度比较

CON组肾小球和肾小管及其间质无明显异常，DM组肾小球系膜外基质聚集、系膜细胞轻度增生，肾小管间质区域增宽、细胞外基质聚集；DM+CoCl2组以上变化较DM组明显改善(见图2)。DM组GSI和IF均较CON组显著增高(t=4.34、4.158,P<0.01)；而DM+CoCl2组GSI和IF较DM组显著降低(t=3.749、3.172,P<0.01)。见表1。

图2 各组肾脏组织学改变及GSI、IF比较(PAS染色，×200)

组别GSIIFCON组0.152±0.0480.184±0.052DM组2.968±0.1591)2.626±0.1641)DM+CoCl2组2.086±0.1712)1.376±0.1352)

注：与CON组比较，1)P<0.01；与DM组比较，2)P<0.01

2.3 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡率比较

CON组未见肾组织细胞明显凋亡，DM组可见部分肾小球周围小管上皮细胞凋亡，DM+CoCl2组凋亡较DM组减少。各组凋亡率比较,DM组较CON组显著增加(15.473±3.064 vs 0.008±0.001，t=5.471,P<0.01)；DM+CoCl2组则较DM组显著减少(7.648±2.673 vs 0.008±0.001，t=5.471，P<0.01)。见图3。

图3 各组大鼠肾小管细胞凋亡率(TUNEL法，×200)

2.4 各组大鼠肾组织内EPO表达水平比较

DM组大鼠肾组织EPO表达水平较CON组显著降低(0.253±0.201 vs 0.741±0.202，t=2.538，P<0.05)，DM+CoCl2组EPO水平较DM组显著增加(0.604±0.167 vs 0.253±0.201，t=2.468，P<0.05)。见图4。

注：与CON组比较，*P<0.05； 与DM组比较，#P<0.05

3 讨论

DKD是导致终末期肾病的主要病因之一，其发病机制尚不明确[12]。传统观点认为其以肾小球损伤为主，但临床观察表明只有近1/3的 T2DM患者表现为典型的肾小球病变，还有1/3的患者不出现或仅有轻微肾小球病变，但这类患者明显存在肾小管间质损伤[13]。因而认为肾脏间质损伤可能参与了DKD的发生与进展。

DM引起的持续慢性缺氧状态对机体多系统均有明显损伤[14]，肾脏是主要靶器官之一，HIF作为诱导与缺氧应激反应有关基因表达的主要转录因子，由α亚基与β亚基组成，其中α亚基既是调节亚基，又是活性亚基。HIF-1α在肾脏广泛表达于肾小管上皮细胞，也表达于髓质乳头和内髓部位的内皮细胞和成纤维细胞，其功能作用研究已见诸较多报道。HIF-2α主要表达于肾小球内皮细胞、管周毛细血管内皮细胞和肾间质成纤维细胞[15]，其干预慢性低氧肾损伤、保护肾功能作用研究相对较少。本文通过构建T2DM大鼠模型，首先观察T2DM可诱导肾组织表达HIF-2α，使用HIF降解抑制剂CoCl2后发现，HIF-2α的表达显著增加；进一步观察肾组织的病理变化及肾小管细胞凋亡结果，显示DM组大鼠在24周时肾小球区出现系膜外基质聚集、系膜细胞轻度增生以及肾小管间质区轻度细胞外基质聚集，GSI和IF升高，肾小球周围小管上皮细胞明显凋亡，而CoCl2处理组上述病理改变减轻，GSI和IF较DM组降低，肾小管细胞凋亡减少。因此认为，T2DM大鼠肾组织HIF-2α表达增高对机体可能有一定保护作用。

以往研究发现EPO受HIF-1α调节，可促进骨髓造血功能，还可减轻缺氧和毒性物质对肾脏细胞的损伤，从而延缓肾病进展[16]。还有报道采用肾大部切除方法建立慢性肾衰动物模型，给予0.1 mg/kg失效EPO(DPO)，6周后观察到肾组织病理变化的改善明显优于生理盐水对照组；且在缺血—再灌注损伤模型的再灌注早期和晚期(再灌注6h后)使用EPO或DPO，均可减少再灌注损伤和肾髓质小管细胞凋亡[17]。表明HIF-1α可能通过上调EPO表达改善肾组织缺血缺氧而对肾脏疾病起到治疗作用。本研究进一步探讨了HIF-2α对T2DM大鼠肾组织EPO表达的调节作用，结果显示DM大鼠肾脏EPO较CON组减少，而CoCl2处理能显著增加肾组织EPO表达。因此认为HIF-2α与HIF-1α作用相似，亦能诱导EPO高表达，增加病变组织的血供和氧供，从而改善和保护肾脏功能。

本实验仅在动物水平进行了研究探讨，其初步结论尚需完善有关实验条件，进一步研究HIF-2α表达变化对T2DM肾小管间质的调节作用及其机制，为临床探讨DKD治疗方法提供理论依据。