脓毒症模型大鼠心肌损伤不同时期线粒体功能的变化

潘子木，胡占升

脓毒症是重症患者的常见死因，往往伴随着心血管系统的异常改变，并累及多个器官[1-3]。目前对脓毒症心肌病尚无特异性的治疗方案。一些观点认为脓毒症心肌病主要是线粒体的氧化应激、自噬中的信号通路以及线粒体质量控制过程中的关系失衡所致，而不是单纯某一方面占主导地位[4-5]。目前对于线粒体的功能主要是从细胞色素C(cytochrome C，CytC)的释放、凋亡途径的激活、ATP产能和细胞代谢产生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)等方面进行评估，心肌线粒体的功能障碍可能与脓毒症所致的心肌损伤关系密切[6-7]。本研究以内毒素诱导的脓毒症模型大鼠为研究对象，探讨心肌损伤与线粒体相关凋亡基因的表达、ATP的产生和作为线粒体呼吸电子传递链终端酶的细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX，线粒体呼吸链复合体Ⅳ)活性之间的关系，为阐明脓毒症心肌病的发生机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 脂多糖(LPS，批号L8880)、ATP含量检测试剂盒(批号BC0305)、COX检测试剂盒(批号BC0945)购自北京索莱宝有限公司；超敏肌钙蛋白I(hypersensitive cardiac troponin I，hs-cTnI)检测试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司；α微管蛋白(α-tubulin)多克隆抗体(批号52866)、半胱天冬酶-3(cysteine aspartic acid specific protease，caspase-3)多克隆抗体(批号184787)、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)多克隆抗体(批号59348)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)兔单克隆抗体(批号32503)购自英国Abcam公司。Abbott i2000Q全自动化学发光免疫分析仪购自美国雅培公司；酶标仪购自美国Thermo Multiskan MK3公司。

1.2 模型建立及分组 体重280～320g、无特定病原体的SD雄性大鼠32只，购自锦州医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK(辽)2014-0004)]，常规饲养于标准环境。依据随机数字表法将大鼠分为对照组和脓毒症组，后者再随机分为脓毒症6h(LPS-6h)、12h(LPS-12h)和24h(LPS-24h)3个时间点，每组8只。脓毒症组大鼠腹腔注射LPS 10mg/kg建立脓毒症模型[8-9]，对照组腹腔注射等体积生理盐水。对动物的处理符合动物伦理学要求。

1.3 化学发光免疫分析法检测hs-cTnI表达 各组大鼠在相应时间点腹腔注射3ml/kg水合氯醛麻醉后，心尖采血2.5～3.5ml保存于促凝管，取血清用于hs-cTnI的检测。采用化学发光免疫分析法，按照试剂盒的步骤以全自动分析仪进行测定。

1.4 Western blotting检测相关凋亡蛋白的表达 各组大鼠在相应时间点腹腔注射3ml/kg水合氯醛麻醉后，剪取心脏，常规提取心肌蛋白，以α-tubulin为内标，采用Western blotting测定caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平，化学发光显影后，Image J软件分析目的条带灰度值，以各条带与α-tubulin灰度值的比值作为各目的蛋白的表达量。

1.5 ATP含量检测 称取约0.1g心肌组织，采用强酸提取法，经碱中和后，取上清按ATP含量测定试剂盒说明书操作，最后计算得到每克组织的ATP含量。

1.6 COX活性检测 称取0.1g心肌组织，提取线粒体，按线COX检测试剂盒说明书的步骤，用分光光度法测定并计算COX活性。将每克组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为1个酶活力单位(U/g)。

1.7 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov法，多个样本间的均数比较采用单因素方差分析，满足方差齐性的两两比较采用LSD-t检验，不满足方差齐性的采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物模型的建立 大鼠在注射LPS后2h逐渐出现竖毛、呼吸频率加快、精神状态欠佳、活动减少；6h后出现腹泻、大小便失禁、进食水减少、蜷缩成一团、眼球开始出现少量的血性分泌物等内毒素血症症状；12h后不易受外界刺激影响，呼吸急促，四肢肌张力降低，皮温低，眼神呆滞，眼球血性分泌物增加。

2.2 血清hs-cTnI水平变化 各组hs-cTnI总体均数不全相同(F=394.63，P＜0.01)。对照组血清hs-cTnI水平为(0.14±0.09)ng/ml，与对照组相比，脓毒症各组血清hs-cTnI水平明显升高(P＜0.01)，且随作用时间延长逐渐增高(表1)。

2.3 凋亡相关蛋白表达变化 对照组凋亡相关蛋白的表达与LPS-6h组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。与对照组比较，LPS-12h组和LPS-24h组caspase-3、Bax表达量增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中LPS-24h组最高，而Bcl-2表达量下降(P＜0.01)，其中LPS-24h组最低。与对照组比较，LPS-24h组Bcl-2/Bax比值明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05，图1)。

2.4 ATP含量变化 与对照组比较，脓毒症组ATP含量降低，其中LPS-24h含量最低，各组总体差异有统计学意义(F=152.706，P=0.000)，两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01，表1)。

2.5 COX活性的变化与对照组比较 脓毒症组COX活性下降，其中LPS-24h组最低，各组总体差异有统计学意义(F=131.522，P=0.000)，两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01，表1)。

表1 各组大鼠血清hs-cTnI水平、心肌组织ATP含量及COX活性比较(±s，n=8)Tab.1 Comparison of hs-cTnI in serum, ATP content and COX activity in myocardial tissues of rats (±s, n=8)

表1 各组大鼠血清hs-cTnI水平、心肌组织ATP含量及COX活性比较(±s，n=8)Tab.1 Comparison of hs-cTnI in serum, ATP content and COX activity in myocardial tissues of rats (±s, n=8)

(1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.01 compared with LPS-6h group; (3)P＜0.01 compared with LPS-12h group

Item Control group LPS group LPS-6h LPS-12h LPS-24h Hs-cTnI (ng/ml) 0.14±0.09 0.53±0.14(1) 2.82±0.72(1)(2) 8.28±0.77(1)(2)(3)ATP (μmol/g) 15.31±2.23 7.58±1.41(1) 3.92±0.52(1)(2) 1.88±0.28(1)(2)(3)COX (U/g) 129.87±10.55 100.46±7.48(1) 68.82±10.88(1)(2) 39.41±9.32(1)(2)(3)

图1 各组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达水平比较Fig.1 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in myocardial tissues of rats

3 讨 论

脓毒症最早的定义为感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。由于SIRS过于敏感、缺乏特异性等原因，经过不断的认识与改进，发展到今天的脓毒症3.0版本，将脓毒症定义为机体对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍[10]。从概念中可以看出“宿主反应”和“器官功能障碍”两个核心，更关注机体在应对感染时所产生的复杂病理生理反应。目前对脓毒症产生的免疫和炎症反应所涉及的病理生理学机制了解仍不全面，但已明确其涉及免疫系统及随之而产生的炎症和微循环衰竭。尽管当前的治疗策略日趋完善，新的治疗观念和方法也在不断更新中，脓毒症和脓毒性休克仍然是重症患者死亡的主要原因。与脓毒症相关的死亡中，超过70%是由于器官衰竭所致，有50%被证实存在心肌功能障碍[11]。心脏是脓毒症重要的靶器官之一，毒素、细胞因子与补体作用的免疫反应、氧化应激与Ca2+超载、细胞凋亡和自噬，以及能量代谢紊乱等均参与了脓毒症心肌病的发生，其中线粒体功能障碍是重要的参与机制之一，被认为可能是通过心肌能量的消耗导致心肌功能障碍[12]。本研究从心肌细胞的线粒体凋亡途径、ATP含量和COX活性三个方面探讨线粒体在心肌损伤时发生的变化。

革兰阴性菌是ICU患者中央导管血流相关感染的主要病因[13]，耐碳青霉烯类抗生素的大肠埃希菌使ICU住院患者的感染和病死率明显增加[14]。作为革兰阴性菌主要成分的内毒素(LPS)，其诱导的脓毒症模型与盲肠结扎穿孔模型相比，具有易复制，重复性好等优点，且能引起与脓毒症患者类似的炎症反应及器官损伤效应。本研究通过腹腔注射LPS建立模拟脓毒症心肌损伤的模型，结果发现脓毒症大鼠血清hs-cTnI较对照组升高，且随LPS作用时间延长而增高，与凋亡蛋白caspase-3、Bax具有同步增长的趋势。

线粒体凋亡途径是细胞凋亡的途径之一。具有促进凋亡作用的Bax和具有抑制凋亡作用的Bcl-2是Bcl-2家族的一对基因。Bax具有较强的促凋亡能力，可使线粒体的膜电位和结构发生改变，然后通过线粒体通路引发不依赖caspase的凋亡反应；同时，Cyt-C直接或间接地从线粒体释放到胞质，引发caspase依赖的凋亡途径。Bcl-2具有稳定线粒体膜的屏障作用可并阻止凋亡诱导因子向细胞核迁移；即使在胞质内钙含量正常的情况下，伴有Bcl-2含量减少的缺血损伤的线粒体也易出现线粒体通道转换孔的开放[15]。因此，Bcl-2和Bax对调节线粒体膜电位的稳定、线粒体的功能和Cyt-C的释放起到至关重要的作用，这使上调Bcl-2和下调Bax可能成为治疗脓毒症相关疾病的途径[16-17]。本研究中脓毒症各组Bax的表达量均较对照组升高，而Bcl-2的表达量较对照组呈进行性减少，Bcl-2/Bax比值降低，提示脓毒症大鼠心肌细胞中bax基因表达占优势，线粒体凋亡基因启动。当上述凋亡信号传至线粒体时，释放入胞质的Cyt-C与凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)和caspase-9前体结合形成凋亡小体，随后激活下游的caspase-3，又可改变线粒体膜通透性，促进Cyt-C释放，形成正反馈，导致线粒体DNA的异常改变。此外，随Cyt-C同时释放到胞质的线粒体促凋亡蛋白通过抑制凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)促进caspase的级联反应来调控细胞凋亡[18]。有研究报道血清较高水平的caspase-3与脓毒症患者的诊断和30d病死率有关[19]。在本研究中，caspase-3的表达量在脓毒症组随作用时间延长而逐渐增加，在12h左右其表达量与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，表明在脓毒症大鼠的心肌组织中，下游凋亡指令的执行者caspase-3被激活，从而促进了细胞凋亡，尤其是在6～12h之间更具意义。

ATP可保证细胞各项生命活动的能量供应，而COX是参与线粒体呼吸链的终端酶，既是电子载体，又是递氢体。细胞色素C的释放是线粒体凋亡途径的中心环节，COX活性的下降使电子传递发生障碍，促进凋亡的发生[20]。同时，电子传递受阻，氧化磷酸化过程障碍，导致线粒体膜电位降低和ATP减少，可能会最终导致脓毒症患者的器官衰竭和死亡[21-22]。在本研究中，与对照组比较，ATP含量和COX活性在脓毒症组均逐渐降低，各组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，表明在促凋亡基因的表达占优势、抑制凋亡的基因表达处于弱势时，ATP供能和线粒体呼吸链受阻。

综上所述，本研究显示，心肌细胞线粒体凋亡通路激活、线粒体功能障碍可能在脓毒症大鼠心肌损伤的过程中发挥了重要介导作用，该结果或可从治疗切入点和时机等角度为脓毒症的临床治疗提供思路。