五种革兰阴性菌血流感染小鼠血清多肽谱的研究

麻雅婷，张可昕，杨明，陈琛，何赏，王成彬

血流感染是目前临床上常见的感染性疾病之一，主要包括败血症和菌血症。细菌性血流感染如果不能及时诊治，可通过血液系统进行播散，随之发展为系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，甚至脓毒症，呈现一种广泛且不受控制的炎症反应，这是造成高病死率的主要原因[1-2]。近年来，由于抗生素、激素及免疫抑制剂的广泛使用，创伤性诊疗技术的开展，血流感染的发病率呈逐年上升趋势，给医护人员及患者带来了巨大的挑战[3]。对于血流感染的诊断，血培养仍然是目前公认的金标准，但所需时间长、阳性率低，限制了其在早期诊断方面的应用，临床亟需快速、准确的血流感染诊断技术。根据近几年各医院统计的血培养病原菌分布情况来看，革兰阴性菌仍占主要地位，常见的临床分离排名前5位的革兰阴性菌分别为大肠埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和变形杆菌(Proteus)[1,4-8]。本研究建立了上述5种细菌的血流感染小鼠模型，并应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)联合磁珠提取多肽技术分析这5种革兰阴性菌血流感染血清多肽图谱的变化趋势，以期为后续寻找诊断标志物并建立相关技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SPF级ICR小鼠，体重25～27g，购自北京维通利华实验动物科技有限公司。小鼠饲养在ABSL2级动物室，在实验前适应环境1周。

1.2 菌株来源 大肠埃希菌标准菌株ATCC25922、肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC1144、鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC747、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853和变形不动杆菌标准菌株ATCC29245均由解放军总医院微生物科惠赠。

1.3 仪器和试剂 MALDI-TOF MS质谱仪、弱阳离子交换磁珠及α-氰基-4羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)均购自北京毅新博创生物科技有限公司；BioexplorerTM软件由北京Bioyong科技公司提供。三氟乙酸(TFA)、分析级乙腈购自北京化学试剂公司。实验用水为Milli Q纯水器制备的去离子水。

1.4 菌液的配制 对获取的标准菌株进行平板分纯及LB液体培养基增菌培养12h后，取100μl菌液于LB液体培养基中继续增菌培养4～6h。大肠埃希菌的LD50浓度参考谢尹晶[9]实验所得。其余菌株在进行液体培养基增菌后，将重悬的菌液配成4.0麦氏浊度，倍比稀释为5个梯度浓度，经小鼠尾静脉注射，每个浓度梯度注射5只小鼠，注射量为0.1ml/10g。连续观察7d，每日观察记录小鼠精神状态和死亡情况。采用Karber法计算各个细菌的LD50。通过前期实验所得，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和变形不动杆菌的LD50分别为1.1×109、9.6×108、1.5×108、8.1×108cfu/ml，在建立细菌性血流感染模型时均以1/2 LD50浓度菌液感染小鼠。

1.5 动物模型的建立及分组 小鼠随机分为大肠埃希菌感染组、肺炎克雷伯菌感染组、鲍曼不动杆菌感染组、铜绿假单胞菌感染组、变形不动杆菌感染组和正常对照组。各感染组分别注射相应菌液，正常对照组注射无菌PBS，注射量均为0.1ml/10g。分别于感染后1、3、6、12、24、48、96、168h眼球取血，5000r/min离心20min，分装其血清，–80℃储存。各组每个时间段10只小鼠。

1.6 血清多肽的提取 具体操作步骤参考多肽提取试剂盒说明书。①涡旋混匀WCX 磁珠，将10μl磁珠、95μl磁珠结合缓冲液、10μl血清样品混匀于0.2ml的PCR管中，室温静置5min后置于磁珠分离器内，静置1min；②小心移去上清，加入100μl磁珠清洗缓冲液，充分混匀后将PCR 管置于磁珠分离器内，静置1min，小心移去上清；③重复步骤“②”2次；④给移去上清含磁珠的管中加入10μl磁珠洗脱缓冲液，混匀后静置1min，将管置于磁珠分离器内，静置1min，使磁珠吸附至管壁，吸出含有多肽的洗脱液并转移至新的0.2ml PCR管中，–20℃储存。

1.7 MALDI-TOF MS质谱分析及数据处理 ①将1μl洗脱液点在ClinTOF-2靶板上，室温干燥后将1μl基质(0.8% HCCA)覆盖样品上，室温干燥；②将靶板放入MALDI-TOF质谱仪，设置激光频率为20Hz，能量为75mv；③用标准品校正仪器后，检测样品，获得由不同质荷比(mass charge ratio，m/z)的多肽峰构成的质谱图。

1.8 统计学处理 所得多肽指纹图谱采用BioexplorerTM软件进行分析，并均经归一化、基线校正和平滑处理。RB算法用以建立区分各感染组和正常对照组。采用秩和检验比较两组峰值强度，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠感染后症状 小鼠在分别感染5种细菌6～12h后均出现精神萎靡，活动减少等；感染后小鼠体重减轻，证明小鼠细菌血流感染模型基本成功。

2.2 血清多肽质谱图的检测及对其差异多肽的分析 采用BioExplorer软件分析各组血清多肽质谱图，得到的峰列表和差异峰的数据见表1。5种革兰阴性菌感染小鼠后，采用MALDI-TOF MS分析每种细菌的差异多肽峰，结果显示，在这5种细菌感染组中共同出现的多肽峰有33个。表达趋势为感染组高于正常对照组的多肽峰有4个，m/z分别为1001.7、1021.7、1230.2和1270.1；表达趋势为感染组低于正常对照组的多肽峰有9个，m/z分别为1513.8、1533.3、2951.3、3113.3、3497.3、5007.3、7506.1、7516.2和7816.7(图1)；其余多肽峰的变化趋势不稳定。

表1 5种革兰阴性菌血流感染小鼠血清多肽指纹图谱差异峰比较(个)Tab.1 Difference peaks in serum polypeptide fingerprints of mice with bacterial bloodstream infection (n)

图1 5种革兰阴性菌血流感染小鼠血清多肽指纹图谱的共有多肽峰Fig.1 Common peaks in serum polypeptide fingerprints of mice with bacterial bloodstream infection

2.3 细菌血流感染模型的建立 根据分析软件内嵌的统计算法，发现KNN模型具有较高的分类效率，通过组合m/z7506.1、7516.2、7816.7、2951.3、5007.3这5个峰建立细菌血流感染诊断多肽指纹图谱模型。该模型在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌血流感染诊断中的正确率分别为90.0%、86.7%、83.0%、85.0%和82.7%。

3 讨 论

近年来，医院分离得到的常见血培养细菌以革兰阴性菌为主要部分，占50.0%～56.1%[1-3,8,10]；其中，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌是临床血培养最常见的5种革兰阴性菌。由于现阶段激素的广泛使用、内置静脉导管的不合理处置，以及广谱抗生素的滥用，血流感染的发病率呈逐年上升趋势，给患者的诊治及合理用药带来了巨大挑战及高额花费[8,11-12]。临床上对于血流感染的诊断主要依靠血培养，但其灵敏度受多方面因素的影响，如患者的身体状况、抽血的时间及部位、血培养的类型及次数等，且耗时较长，假阳性率高，限制了该方法在早期诊断血流感染方面的效用。临床现阶段常用C反应蛋白、降钙素原、白介素6等指标来辅助诊断，但其特异性低，在许多非感染的炎症反应疾病中也有升高，使得辅助早期诊断血流感染的价值受到了限制。质谱是一种快速、敏感和高效的技术，现已广泛应用于肿瘤、免疫性疾病及微生物菌种的鉴定等方面[13-16]，对于细菌性血流感染的血清学研究刚刚起步。笔者在前期相关研究[17]的基础上，通过建立5种单细菌性血流感染模型，分析其差异多肽指纹图谱，以此来辅助诊断血流感染。

通过分析比较5个细菌感染组和正常对照组的多肽指纹图谱，共发现有33个共同出现的峰。提示在革兰阴性菌造成的血流感染反应过程中，共同激发了相似的免疫反应。革兰阴性菌致病物质主要为内毒素，为其细胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由特异性的O抗原、非特异性的核心多糖和脂质A三部分组成[4-5]。在细菌存活时，LPS仅为细胞壁的结构组成成分，通常不表现毒性作用；当细菌死亡裂解后，LPS游离出来，发挥毒性反应。其致病机制可能为LPS通过脂质A与血液中的LPS结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)结合后，再与单核-巨噬细胞表面的受体CD14分子结合，形成LPS-LBP-CD14复合物，并与Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)及辅助受体髓样分化因子2相互作用，触发细胞内信号转导级联反应，激活单核-巨噬细胞产生和释放肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8等细胞因子，继而刺激免疫细胞、内皮细胞和黏膜上皮细胞等，产生一系列细胞因子、生物活性介质、急性期蛋白等，引起多种组织器官或全身性的病理生理反应，常见症状包括发热、寒颤、精神萎靡等[18-19]。MALDI-TOF质谱检测发现，在这些革兰阴性菌引起的血流感染血清中有共同的多肽峰出现，从而印证了革兰阴性菌所造成的免疫反应。一些常见的炎症因子被发现，血清中纷繁复杂的物质中，一些小分子的多肽在今后辅助诊断血流感染方面仍然有巨大的价值。

除了5种细菌感染后血清中检测到的共有特征峰外，每种细菌感染都有各自独有的特征峰出现并表现出一定的趋势。大肠埃希菌引起的血流感染血清多肽峰的变化趋势，我们之前的研究已有阐述[17]。在肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌引起的血流感染中，同样发现一些多肽峰随着感染时间的不断延长呈上升趋势，分别为肺炎克雷伯菌感染中的m/z 1020.7、1203.9、1842.3；鲍曼不动杆菌感染中的m/z 1375.8、1436.3、1277.4；铜绿假单胞菌感染中的m/z 1152.5、1325.7；变形杆菌感染中的m/z 6978.9、6987.4。这些多肽峰的出现，提示机体为了应对感染可能产生一系列新的物质，其有望成为新的辅助诊断血流感染的标志物。还有一些多肽峰是随着感染时间的不断延长呈现先上升后下降的趋势，分别为肺炎克雷伯菌感染中的m/z 1003.7、1916.9、3398.2；鲍曼不动杆菌感染中的m/z 1001.7、1172.8、6985.1；铜绿假单胞菌感染中的m/z 1047.6、1807.8、4083.3；变形杆菌感染中的m/z 1104.1、1151.3、1281.7、1322.5、1366.9，这些多肽峰在感染的早期呈现一个高水平的状态，随着感染的不断进行，机体抗感染反应出现，使得这些高水平状态的物质含量不断下降，预示着这些多肽峰所对应的物质有可能成为早期升高的急性时相反应蛋白来辅助诊断血流感染。

MALDI-TOF MS技术作为蛋白组学研究的新技术，现已广泛应用于肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、肾病等疾病[20-22]新型标志物的寻找中。在微生物研究方面主要应用于细菌、真菌等的鉴定中。由于微生物中应用质谱鉴定还需经过培养等环节，通过挑取单个菌落进行质谱分析，根据已有的数据库进行比对得出菌种鉴定的结果，这其中就很大程度上依赖于数据库的更新及操作的规范程度，由于很多菌种基因结构背景相近，质谱图很难区分，所以给临床微生物血流感染的诊断带来了一定的不便[23-24]。目前，对于血流感染血清学多肽方面的研究还尚未见大量报道，而收集临床血流感染标本时患者基础疾病复杂，难以控制单一变量，故本研究通过建立ICR血流感染小鼠模型研究其血清学多肽的变化来寻找具有潜在临床价值的生物标志物，用于辅助诊断血流感染，为临床血流感染的防治提供良好的依据。

本研究重点分析了5种常见革兰阴性菌血流感染的血清多肽指纹图谱，发现了其共有的特征峰及每种细菌感染后的特征峰，由此建立相应的诊断模型，有望辅助早期诊断血流感染。今后我们还将建立常见革兰阳性菌、真菌性血流感染等模型，分析革兰阴性菌、革兰阳性菌及真菌之间的血清差异多肽指纹图谱，同时对寻找到的差异多肽峰进行二级质谱多肽鉴定，以期为血流感染新型标志物的寻找奠定基础。