稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子的L929细胞株的建立*

陆 琤 周晨辰 张鹏飞 张 硌 张 鹏*

L929细胞是小鼠表皮成纤维细胞，L929细胞培养上清中含有较高浓度的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)[1]。M-CSF是一种由成纤维细胞或上皮细胞等产生的细胞因子，能调节巨噬细胞的生存、增值和分化。使用含L929上清的条件培养基与重组M-CSF诱导分化获得的骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)在形态、纯度、杀菌能力和吞噬细菌能力等方面无显著差异[2]。因此，含L929上清的条件培养基可用来代替昂贵的重组M-CSF诱导分化骨髓巨噬细胞。但该条件培养基仅限用于诱导分化鼠的巨噬细胞，并不能用于人的巨噬细胞的培养。基于此，本研究通过慢病毒重组系统将人M-CSF基因重组入L929的基因组中，使其能高效表达人巨噬细胞集落刺激因子(human macrophage colonystimulating factor，hMCSF)，为体外培养人源的巨噬细胞提供廉价又方便的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

包装质粒pMD、SPA为本实验室保存，载体质粒pCDH-X、pCDH-hMCSF-HA由北京梓熙生物科技有限公司合成。293TX细胞和L929细胞为本实验室保存。脂质体转染试剂(Lipofectamine2000)购自美国Invitrogen Life Technologies公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；血清购自美国Hyclone；0.22 μm滤器购自美国PALL公司；超滤离心管购自美国millipore公司。增强化学发光(enhanced chemi luminescence，ECL)显影试剂购于美国Thermo公司，其余常用试剂均为国产分析纯。

1.2 载体质粒pCDH-hMCSF-HA的构建

从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站上找到hMCSF序列后连接血凝素抗原(hemagglutinin antigen，HA)标签蛋白便于蛋白质印迹(western blot，WB)检测。将该目的基因片段插入载体pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro的EcoR1/BamH1两个酶切位点之间，该载体质粒pCDH-hMCSF-HA交由北京梓熙生物科技有限公司合成。

1.3 慢病毒包装

293TX细胞于对数生长期时接种于60 mm直径的培养皿中，用含10%胎牛血清的高糖培养基(dulbecco"s modified eagle medium，DMEM)培养。将1μg pMD、3μg SPA、4μgpCDH-X/pCDH-hMCSF与100 μl无血清1640培养基温和混匀，Lipofectamine 2000 16 μl与100 μl无血清1640培养基温和混匀，室温静置5 min，再将二者混匀，室温静置20 min，将混合液缓慢滴入293TX细胞中，即完成包病毒过程。转染后8 h或过夜后换液，24～36 h收一次上清，补液5 ml。约72 h后再收上清，3000 r/min离心5 min，使得细胞等杂质沉淀，取上清用0.22 μm滤器过滤后加入超滤离心管，5000 r/min，离心20 min后得约200 μl浓缩病毒，置于-40 ℃保存或立刻使用。

1.4 L929细胞培养及感染

取适量L929细胞接种于60 mm直径的培养皿内，加入含20%胎牛血清的DMEM，于37 ℃、5%CO2培养。当细胞长至对数增长期时，取少量接种至12孔板中的一孔，加入浓缩病毒约20 μl，感染后72 h，在倒置荧光显微镜下，激发光(450～490 nm蓝光波长)照射下，观察L929感染情况。加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞，终浓度为20 ng/ml。第2 d更换培养液，未感染成功的细胞已被杀死，感染成功的细胞完好，待感染成功的细胞长满后，将其接种入新的60 mm直径的培养皿中进行扩大培养。

1.5 WB方法检测hMCSF表达

取适量过表达pCDH-X、pCDH-hMCSF-HA的L929细胞，并收集其上清，制成上样液，用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)凝胶分离；90 mA，3 h电转至硝酸纤维素膜；用5%脱脂奶，水平脱色摇床室温震荡封闭1 h；与1∶1000稀释后的HA一抗4 ℃孵育过夜；三羟甲基氨基甲烷盐吐温(tris buffered saline tween，TBST)缓冲液漂洗3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG二抗，水平脱色摇床室温孵育1 h；TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min；用增强化学发光(enhanced chemi luminescence，ECL)试剂盒显影并观察结果。

2 结果

2.1 慢病毒感染L929细胞结果

(1)用于包病毒的载体pCDH-X/pCDH-hMCSFHA能够表达绿色荧光蛋白，因此未被慢病毒感染的L929在荧光显微镜下不发光(如图1所示)。

(2)被病毒pCDH-X感染过的L929在荧光显微镜下发绿色荧光，表明病毒感染成功(如图2所示)。

图1 未处理的L929细胞荧光显微镜图(×40)

图2 过表达pCDHX的L929细胞荧光显微镜图(×40)

(3)被病毒pCDH-hMCSF-HA感染过的L929在荧光显微镜下发绿色荧光，表明病毒感染成功(如图3所示)。

图3 过表达pCDH-hMCSF-HA的L929细胞荧光显微镜图(×40)

2.2 WB检测结果

WB结果显示，过表达pCDHX的L929细胞培养上清(L929pCDH-X SUP)和细胞裂解液(L929pCDH-X CELL)检测不到特异性条带，而在过表达pCDH-hMCSF-HA的L929细胞的培养上清(L929pCDH-hMCSF-HA SUP)和细胞裂解液(L929PCDH-hMCSFHA CELL)中检测到特异性条带，且L929PCDH-hMCSF-HA SUP中检测到的特异性条带比L929pCDH-hMCSF-HA CELL稍大，是因为M-CSF是一种由链间二硫键连接而成的同源二聚体糖蛋白，由于其糖基化和蛋白水解等翻译后修饰会产生不同的可溶性形式，分子量为40～90 kDa[3-8]。本研究结果检测到的特异性条带大小符合上述范围(如图4所示)。

图4 western blot检测上清及细胞中hMCSF的表达示图

3 结论

本研究在设计载体质粒pCDH-hMCSF时，在目的基因hMCSF后连入HA标签蛋白。HA标签蛋白，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，为9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小，易于用Anti-HA抗体检测。

本研究采用嘌呤霉素作为抗性筛选剂，是由于pCDH载体上含有嘌呤霉素抗性基因，因此加入终浓度为20 ng/ml的嘌呤霉素可筛除未感染成功的细胞。加入嘌呤霉素后存活的细胞生长较好，与野生型的L929细胞相比，在形态上及生长速度上无明显差异。

hMCSF具有能够刺激巨噬细胞生长和分裂的功能，临床及科研中均具有重要的应用价值和前景。天然来源的M-CSF含量低，且分离纯化不易，因而价格昂贵[9-10]。体外培养巨噬细胞的传统方法主张每2～3 d补加细胞因子，以保证足够的细胞因子浓度，但这种方法花费巨大。而L929细胞增殖速度快，耐受力强，容易培育，通过慢病毒感染的L929细胞能高效表达人源M-CSF，可替代价格昂贵的细胞因子，其方法的培养来源于人体的巨噬细胞，比来源于鼠的巨噬细胞更接近人体机能，可作为体外研究的材料而进一步为研究巨噬细胞生物学作用创造条件。