粘弹性参数与大鼠脂肪肝程度的相关性研究*

苏 晨 李国洋 刘 冬 钱林学* 曹艳平

随着居民生活水平提高，肥胖患者日益增多，而非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率也在逐年升高[1]。NAFLD是一种由于脂滴在肝细胞内堆积进而形成疾病，根据肝脏中是否出现炎症细胞，可以分为单纯性脂肪变性(simple steatosis，SS)和脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[2-3]；其中SS若不及时诊断和治疗，则会进展为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25%[4-7]。因此，早期诊断NAFLD尤为重要。

超声检查是初步筛选NAFLD的首选方法，其价格低廉，无放射损伤，但对轻度脂肪肝不敏感，且难以鉴别肝纤维化[8-9]。目前，超声弹性成像已被初步证实在评估慢性肝炎及肝纤维化程度上具有重要价值[10]。现有的超声弹性成像技术都是基于假设肝脏是纯弹性体的理论而发展的方法[11-12]。然而，所有生物组织都具有粘弹性，所以利用现有的超声弹性成像技术来早期诊断SS并不理想[13-14]。压痕松弛实验是一种用于表征固体粘弹性的可靠方法，因此，本研究旨在应用压痕松弛实验得到相关粘弹性参数，探究其与非酒精性肝脏脂肪变性程度的相关性，从而为其将来用于早期诊断SS奠定基础[15]。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

选取健康清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，体重为(200±20)g，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养环境为无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级，由首都医科大学北京友谊医院动物实验中心饲养。40只SD大鼠在取得病理结果之前，根据造模方法，将其随机分为对照组(10只)和实验组(30只)；实验中对照组和实验组各死亡3只；根据最终病理结果将剩余的34只SD大鼠重新分为正常(S0)组(7只)、轻度肝脏脂肪变性(S1)组(7只)、中度肝脏脂肪变性(S2)组(10只)和重度肝脏脂肪变性(S3)组(10只)，共4组。

1.2 仪器与饲料

采用ElectroForce®3100型压痕实验仪(美国Bose公司)。高脂饲料选用MD12033 60%高脂饲料(江苏美迪森公司)。

1.3 非酒精性脂肪变性肝脏模型建立

清洁级雄性SD大鼠40只，在取得病理结果之前，将其随机分为2组，即对照组(10只)和实验组(30只)，一周适应性喂养之后，对照组10只大鼠继续进行基础喂养，实验组30只大鼠更换高脂饲料(60%高脂饲料，MD12033，平均每只20 g/d)喂养，之后每隔2周依次处理实验组10只及对照组3～4只。

1.4 实验前准备

将所有进行实验的SD大鼠仰卧位固定在实验台上，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)进行腹腔麻醉，在剑突水平做腹横切口(1.5～2.0 cm)，充分暴露肝脏后，将肝动脉和肝门静脉与下腔静脉均进行结扎，结扎过程结束后，将肝脏分离。

1.5 实验原理与方法

粘弹性普遍存在于生物组织中，在外界应力作用下会出现形变滞后现象，当总应变保持不变时，组织内部的变形恢复力(回弹应力)会随时间逐渐降低[16]。

压痕实验是一种用于表征固体粘弹性的可靠方法，在表征生物材料力学特性方面具有特殊的优势[15，17-18]。此实验应用既往研究中已形成的理论，通过球形压头和离体肝脏组织接触并加压使其产生形变后(实验压头直径3.5 mm，肝脏模型被压下约1 μm)，保持压头不动，由下方压力传感器测量压力变化，获得载荷—位移曲线，从而得到可用于描述组织粘弹性特性的相关参数，即松弛时间(s)(t1，t2)，表示其在形变一定的情况下，组织内部应力降低的时间，t1为应力下降开始时间，t2为应力降低到平衡时的时间[15，19]；应力松弛程度(g1，g2)，表示组织内部应力降低的程度，g1为下降开始时的变化程度，g2为降低到平衡时的变化程度。实验仪器以及粘弹性参数获取过程如图1所示。

图1 压痕实验示意图

1.6 肝脏粘弹性测定

在压痕实验过程中，本研究选择SD大鼠离体肝脏中2个较大的肝叶，即肝左外侧叶(left lateral lobe，LLL)和肝中叶(median lobe，ML)，并对每个肝叶各进行2次独立测试，在每个SD大鼠离体肝脏各获得4组实验数据，取其平均值作为该肝脏的最终结果。实验过程中的环境温度和湿度分别约为25 ℃和50%，实验用肝脏以及选取实验点位置如图2所示。

1.7 肝脏病理检测

将实验点处的肝脏组织剪下，固定于10%的福尔马林液体中，于24 h更换福尔马林液，72 h取出，常规石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色。肝脏脂肪变性程度参照脂肪肝病理诊断Brunt分级标准[20]。

表1 压痕实验结果

表1 压痕实验结果

注：表中t1为应力下降开始时间(秒)，t2为应力降低到平衡时的时间(秒)；应力松弛程度(g1，g2)表示组织内部应力降低的程度，g1为下降开始时的变化程度，g2为降低到平衡时的变化程度。

参数 S0组(7只) S1组(7只) S2组(10只) S3组(10只)g1 0.453±0.034 0.483±0.023 0.482±0.023 0.453±0.027 g2 0.228±0.008 0.215±0.007 0.240±0.026 0.235±0.014 t1(s) 0.520±0.090 0.481±0.043 0.551±0.103 0.599±0.068 t2(s) 24.410±2.302 24.781±1.926 28.666±2.120 31.577±2.110

图2 大鼠肝脏图及实验点选取示意图

1.8 统计学方法

应用Excel表格建立数据库，采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，粘弹性参数与大鼠脂肪肝程度的相关性采用Pearson相关性分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果

动物模型共40只，获得病理结果前，对照组和实验组各死亡3只。将SD大鼠肝脏进行病理分析后，根据脂肪肝病理诊断Brunt分级标准，将剩余36只SD大鼠重新分组，最终得到S0组7只，S1组7只，S2组10只，S3组10只，如如图3所示。

图3 SD大鼠最终分组数量及不同程度脂肪变性肝脏的病理切片图(×40)

2.2 SD大鼠肝脏粘弹性参数一般情况

SD大鼠肝脏的粘弹性参数都通过压痕实验获得，4个粘弹性参数分别以“平均值±标准差”表示。SD大鼠肝脏的松弛程度(g1)测值范围为0.426～0.506；松弛程度(g2)测值范围为0.208～0.266；松弛时间(t1)测值范围为0.438～0.667；松弛时间(t2)测值范围为22.108～33.687(见表1)。

2.3 粘弹性参数与大鼠脂肪肝程度相关性

Pearson相关分析显示，SD大鼠肝脏脂肪变性程度与松弛时间(t1，t2)呈正相关，差异有统计学意义(r=0.405，r=0.802；p＜0.05)；其中，与松弛时间(t2)相关性更好；肝脏脂肪变性程度与应力松弛程度(g1，g2)均不相关，见表2。

表2 Pearson相关分析结果

3 讨论

NAFLD的早期诊断对临床工作有着重要意义，该病变基础是脂滴在肝细胞内堆积进而造成肝脏代谢和功能异常[7，20-21]。近年来，超声弹性成像被广泛应用于肝脏疾病的诊断，对其在脂肪性肝病中的应用也有报道[22-26]。在过去的20年中，已经形成了数种超声弹性成像方法。其中剪切波弹性成像(shear wave elastography，SWE)使用最为广泛，因其能够定量地表征肝组织的弹性特征[27]。在该方法假设组织是纯弹性体，通过测量剪切波速(shear wave velocity，SWV)，应用公式：E=3ρSWV2(其中ρ表示组织密度)来计算组织弹性模量(用E表示)[11-12]。然而，所有生物组织都具有粘弹性，单纯测量其弹性特征有一定的局限性[13-14]。

以往为了弥补此方法的缺陷，研究者们对NAFLD发展过程中肝脏的粘弹性变化进行了不断探索。Barry等[13]对70只小鼠的肝脏进行了离体实验，并得出利用爬行波的频散可以反映组织粘弹性，并用于区分肝脏脂肪变性的程度。此外，一项研究用动态力学分析(dynamic mechanical analysis，DMA)方法来评估体外大鼠模型的肝组织粘弹性，也证明肝组织粘弹性与脂肪变性程度相关[28]。然而，Nightingale等[29]利用剪切波频散原理，对135名NAFLD患者进行了肝脏粘弹性测定，研究结果显示，未观察到粘弹性参数与不同的脂肪变性阶段之间的相关性。

本研究表明，出现这种结果不统一的主要原因是由于DMA中使用的正弦负载的频率通常≤50 Hz，而剪切波的频率通常在数百赫兹的数量级。基于此，结合DMA和剪切波频散分析都显示出评估肝脏脂肪变性阶段的粘弹性特征的局限性，本研究旨在探究脂肪肝粘弹性在压痕实验的时间尺度(秒级)是否有相关性[15，30]。经过实验证实以及统计学分析，本研究结果显示，肝脏脂肪变性程度与松弛时间(t1，t2)呈正相关，其中，与反映组织内部应力降低到平衡时的时间(t2)相关性更好。

本研究尚有不足之处：①通过压痕松弛实验来获得离体肝脏的粘弹性参数，这种有创诊断方法仍处于研究阶段，不适于在此阶段直接应用于临床。然而近期有学者提出了基于超声的松弛和(或)蠕变实验[28-31]借助于该方法，未来可以将压痕实验应用于临床；②NAFLD包括一系列临床和组织病理学变化，包括单纯性脂肪变性，伴有炎症的脂肪变性，脂肪性肝炎，肝硬化和肝细胞癌[32]。本研究中，SD大鼠肝脏脂肪变性模型未出现明显的炎症和纤维化，因此，炎症和纤维化如何影响肝组织的粘弹性仍需进一步研究。

4 结语

在本研究中，应用压痕实验来评估NAFLD大鼠模型中肝组织的粘弹性，其结果表明，随着肝脏脂肪变性程度的增加，粘弹性参数松弛时间(t1，t2)与非酒精性肝脏脂肪变性程度显著相关。此发现为脂滴在肝脏中堆积进而影响肝脏机械特性的现象提供了新的信息，并可能有助于早期诊断NAFLD。