牛卵泡颗粒细胞PRSS35表达模式及功能研究

毕锡麟，王 锴，李鹏飞，景炅婕，韩 琦，吕丽华*

(1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801； 2.山西农业大学生命科学学院，太谷 030801)

牛属于单胎动物，在每个发情周期中，只有一个卵泡发育成熟并最终排卵[1]，卵泡的生长发育与排卵在牛繁殖过程中起重要作用。在牛卵泡发育过程中，会受到多种因素的影响，激素类物质如促卵泡素FSH会启动牛卵泡发育波[2]、促黄体素LH则在卵泡成熟排卵及黄体形成时发挥作用[3]；生长因子与细胞因子也在牛卵泡发育过程中起重要作用，如胰岛素样生长因子IGFs会促进卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs)与内膜细胞增殖与分化，促进GCs分泌E2[4]；此外，一些重要的基因与蛋白(如CART等)也会在牛卵泡发育过程中起重要作用[5]。本课题组前期以母牛为研究对象，利用高通量深度测序技术筛选出10个与牛卵泡发育相关的基因，其中PRSS35在转录组(PDF1和ODF1)的差异表达倍数为2.4，推测PRSS35可能与牛卵泡发育密切相关[6]。研究表明，PRSS35特异性表达于小鼠卵巢，并在小鼠卵泡发育和排卵过程，以及黄体形成与退化中表达量上调，推测其可能会促进卵泡发育并诱导排卵[7-10]。功能研究表明，PRSS35可能与卵母细胞受精潜力[11]、人唇腭裂[12]、肾纤维化[13]相关。目前有关PRSS35的研究主要集中于模式动物小鼠与人上，在牛上未见报道，根据基因在物种之间的保守性，推测其在牛上具有相同效果。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting试验分别从mRNA和蛋白水平对PRSS35在牛卵泡GCs的表达进行定量研究，通过免疫组织化学试验对PRSS35蛋白在牛卵泡中的表达进行定位分析；应用基因沉默技术合成siRNA并转染GCs，通过qRT-PCR和细胞凋亡检测等观察PRSS35对GCs增殖的影响，初步探明PRSS35与牛卵泡发育的关系，为进一步揭示PRSS35及其家族蛋白在牛卵泡发育过程中的作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

选取18月龄正常发情的海福特母牛，PGF2α同期发情处理后，B超超声波监测(每12 h 1次)并记录卵泡大小变化，当其中一个卵泡直径增长率显著高于其它卵泡时，即出现优势卵泡(dominant follicle, DF)，其它卵泡则为从属卵泡(subordinate follicles, SF)。屠宰并采集双侧卵巢，分离DF和SF。本试验3头牛的DF和SF用于总RNA提取，另3头 牛的DF和SF用于总蛋白提取，1头牛的DF和SF用于免疫组织化学研究(以上材料均为课题组前期保存)；细胞培养用GCs采自山西省文水县肉牛屠宰场。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA和总蛋白的提取 将分离的DF和SF分别置于灭菌DPBS中，用手术剪将卵泡剪开，刮刀轻刮卵泡内壁并收集GCs。Trizol法提取总RNA，提取步骤按RNAiso Plus试剂盒说明书进行；将GCs分别置于液氮预冷的研钵中研磨后，PMSF以1∶1 000比例制备RIPA裂解液提取总蛋白。测定总RNA和总蛋白浓度，-80 ℃保存备用。

1.2.2 RT-PCR 按照RT-PCR kit说明书合成cDNA链。采用两步法，第1步：去除gDNA反应，建立10 μL反应体系：总RNA 1 μL，gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，RNase Free dH2O定容至10 μL，充分混匀，置于PCR仪，42 ℃ 2 min；第2步：反转录反应，将EP管从PCR仪中取出，继续加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer Ⅱ 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，用手轻弹EP管使其混匀，置于PCR仪，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 qRT-PCR检测 根据NCBI上公布的牛PRSS35 mRNA序列(NM_001035457.3)和内参基因RPLP0 mRNA序列(NM_001012682.1)，使用Primer 5.0设计引物(表1)。qRT-PCR引物跨越内含子，引物跨越内含子会避免基因组DNA的影响，从而提高试验的准确性。

qRT-PCR反应体系20 μL，反应条件： 95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，45个循环；熔解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的基因和内参基因均在同一反应条件下进行反应，反应结束后测定CT值。

表1qRT-PCR引物序列

Table1PrimersofqRTPCR

基因名称Gene symbol引物序列(5′→3′)Primer sequence退火温度/℃Annealing temperaturePRSS35F:CCGACAGCAGGTTCAGCAT,R:AGTGGGCAGCGGTTAGGAC65RPLP0F:CAACCCTGAAGTGCTTGACAT,R:AGGCAGATGGATCAGCCA65

1.2.4 免疫组织化学检测 分离后的DF和SF置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，经脱水、浸蜡、包埋，制成6 μm厚的切片。按照SP Rabbit HRP Kit(DAB)说明书进行操作，二甲苯脱蜡后梯度酒精水化；试剂A(endogenous peroxydase enzymes blocking buffer)室温孵育10 min，PBS清洗；试剂B(normal goat serum for blocking)室温孵育10 min，PBS清洗；试验组滴加兔抗PRSS35(1∶100稀释)，对照组滴加PBS作为对照，湿盒4 ℃过夜孵育14 h；37 ℃恒温培养箱复温30 min，PBS清洗；试剂C(goat anti-rabbit IgG)室温孵育10 min，PBS清洗；试剂D(streptavidin-HRP)室温孵育10 min，PBS清洗；DAB显色10 min，蒸馏水冲洗；苏木精复染40 s，蒸馏水冲洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明；中性树胶封片。利用Olympus光学显微镜观察并采集图像。

1.2.5 Western blotting检测 根据SDS-PAGE Gel Kit说明书配置12%的分离胶和5%的浓缩胶，蛋白上样缓冲液与蛋白样品以1∶4比例混合，95 ℃ 5 min蛋白变性后，上样至凝胶加样孔，上样量为20 μL。80 V 30 min浓缩胶电泳；120 V 50 min分离胶电泳。将目的条带所在的胶条进行割胶，与NC膜贴合，100 V 90 min，进行转膜电泳。5%封闭蛋白干粉封闭90 min。一抗4 ℃孵育过夜14 h，试验组PRSS35兔抗以1∶1 000稀释，对照组一抗β-actin 兔多克隆抗体以1∶2 000稀释，TBST清洗10 min，重复3次；二抗室温孵育90 min，HRP-山羊抗兔IgG以1∶3 000稀释，TBET清洗10 min，重复3次；NC膜涂发光液后凝胶成像系统进行曝光。

1.2.6 siRNA的设计与合成 根据NCBI数据库已知的牛PRSS35基因序列(NM_001035457.3)，按照siRNA设计原则[14]，Invitrogen在线设计1对PRSS35基因的siRNA前体寡核苷酸序列，序列及阴性对照(siNC)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2siRNA前体寡核苷酸序列

Table2siRNAprecursoroligonucleotidesequence

基因名称Gene symbol序列(5′→3′)SequencesiPRSS35 FGGAGCCAAGACAGUCUGAATTsiPRSS35 RUUCAGACUGUCUUGGCUCCTTsiNC FUUCUCCGAACGUGUCACGUTTsiNC RACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.2.7 卵泡GCs细胞培养液配置 卵泡GCs细胞培养液选择MEMα细胞培养液，配置方法：双抗(青霉素100 000 IU·L-1，链霉素0.1 g·L-1)、两性霉素B(1 mg·L-1)、HEPES(0.02 mol·L-1)、BSA(1 g·L-1)、NaHCO3(0.84 g·L-1)、NEAA(1.1 mg·L-1)、NaSeO3(40 μg·L-1)、转铁蛋白(5 mg·L-1)、雄烯二酮(10-6mol·L-1)、牛胰岛素(10 ng·mL-1)、胰岛素样生长因子(1 ng·mL-1)、FSH(25 ng·mL-1)，MEMα基础培养液填至50 mL，充分混匀，4 ℃备用。

1.2.8 卵泡GCs体外培养 刮取GCs后，用细胞培养液重悬细胞并离心，弃上清；将GCs接种于10 cm无菌培养皿内，补足细胞培养液至10 mL，轻晃培养皿，37 ℃，5%CO2进行原代贴壁细胞培养。每48 h换一次培养液，当观察到细胞铺满培养皿，进行细胞传代。

1.2.9 siRNA转染卵泡颗粒细胞 选择传代至3代或4代的牛卵泡GCs接种于24孔板进行培养，当细胞密度达到70%～90%时，参照Lipofectamine®3000说明书步骤进行转染。培养48 h后荧光显微镜检测。

1.2.10PRSS35基因沉默效果检测 培养48 h后，取出24孔细胞培养板，吸去部分GCs，无菌PBS清洗两次，分别添加300 μL Trizol提取总RNA；qRT-PCR检测沉默组(siPRSS35组)、阴性对照(siNC组)和空白对照组(Blank组)中PRSS35 mRNA的表达。

1.2.11 培养液E2浓度测定及细胞凋亡检测 筛选PRSS35基因沉默效果检测合格的培养组，应用牛E2Elisa kit对培养液进行E2浓度测定；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒对凋亡细胞进行荧光染色，因细胞凋亡过程中细胞核DNA的非正常断裂，可被荧光染料染色，从而可通过荧光显微镜观察到凋亡的细胞。使用生物软件ImageJ对凋亡细胞与总细胞进行细胞计数，计算凋亡细胞占总细胞数的百分比即为凋亡细胞百分率。

1.3 数据分析

qRT-PCR检测结果采用△△CT法计算各目的基因的相对表达量，各基因的相对表达水平=2-△△CT；各基因表达量经内参基因RPLP0校正，分别设定PRSS35基因在SF和siNC组的表达量作为对照组；所有结果均采用“平均值±标准差”表示，统计结果应用SPSS 17.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 总RNA凝胶电泳检测

1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，图1中可清晰看出3条带，分别为28S RNA、18S RNA、5S RNA。总RNA的纯度比较高，且完整性好，可用于qRT-PCR试验。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Electrophoresis pattern of total RNA

2.2 牛卵泡GCs中PRSS35 mRNA表达差异分析

牛卵泡GCs qRT-PCR分析结果显示(图2)，PRSS35基因在牛DF中的表达量是SF的10.69倍(P<0.001)。

**. P<0.001，下同
**. P<0.001,the same as below
图2 PRSS35基因在牛DF和SF中的表达
Fig.2 qRT-PCR analysis of PRSS35 mRNA expression in bovine DF and SF

2.3 牛卵泡GCs中PRSS35蛋白表达差异分析

Western blotting对PRSS35在牛DF与SF颗粒细胞中表达量进行对比分析，并与内参蛋白β-actin进行比较，从图3A可见，PRSS35在DF中的条带较粗较浓；对蛋白印迹进行灰度值分析显示，PRSS35在DF中的表达量极显著高于SF(P<0.01)(图3B)，该结果与qRT-PCR对PRSS35 mRNA的分析结果相一致。

2.4 PRSS35在牛卵巢DF和SF中的免疫组织化学定位分析

免疫组化分析表明，PRSS35在牛卵巢DF和SF均有表达(图4A, B, C)，对照组无特异性显色(图4a, b, c)；且PRSS35在牛卵巢DF和SF的颗粒层、膜细胞层均有表达。

2.5 牛卵泡颗粒细胞转染效果检测

设计并合成的前体寡核苷酸序列siPRSS35和siNC带有绿色荧光标记，转染48 h，荧光显微镜检测表明，与对照组相比，可明显观察到绿色荧光(图5)。

利用qRT-PCR方法对转染siRNA 48 h后PRSS35基因在沉默组、阴性对照组(siNC)以及空白对照组中的表达量进行分析，结果显示，PRSS35基因在沉默组的表达量极显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.001)，阴性对照组和空白对照组间无显著差异(图6)。

2.6 培养液E2浓度检测

ELISA法检测培养液E2浓度结果表明，沉默组E2浓度极显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)，阴性对照组和空白对照组间无显著差异(图7)。

*. P<0.01， 下同
*. P<0.01， the same as below
图3 PRSS35蛋白在牛DF与SF中的Western blotting检测(A)与灰度值分析(B)
Fig.3 Western blotting bands (A) and grey value analysis (B) of PRSS35 protein in bovine DF and SF

GC.颗粒层；TC.膜细胞层
GC.Granulosa cells; TC.Theca cells
图4 卵巢组织PRSS35 的表达(免疫组化, 400×)
Fig.4 Expressions of PRSS35 in the ovary (immunohistochemistry, 400×)

2.7 牛卵泡颗粒细胞凋亡检测

TUNEL细胞凋亡检测结果显示，空白对照组、阴性对照组细胞凋亡数明显低于沉默组(图8)；凋亡细胞百分率分析结果显示，沉默组凋亡细胞百分率极显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.001)，空白对照组和阴性对照组间无显著差异(图9)。

图5 siPRSS35和siNC转染效果图(40×)
Fig.5 Transfection effect of siPRSS35 and siNC(40×)

图6 转染siRNA 48 h牛颗粒细胞PRSS35 mRNA的表达
Fig.6 Expression of PRSS35 mRNA at 48 h after siRNA transfection

图7 细胞培养液中E2浓度
Fig.7 The E2concentration in cell culture media

图8 细胞凋亡检测情况(40×)
Fig.8 Cell apoptosis detection(40×)

图9 颗粒细胞凋亡率分析
Fig.9 Apoptosis rate analysis of GCs

3 讨 论

雌性哺乳动物生殖系统的独特之处在于每次发情周期都进行着快速、广泛的组织重构，其中卵泡生长、排卵以及黄体的形成与退化均受蛋白的严格调控[15-16]。牛卵泡生长发育过程会受到诸如激素类物质、生长因子与细胞因子以及一些重要基因与蛋白的调控[2-5]。PRSS35是丝氨酸蛋白酶家族成员之一，作为蛋白水解酶在生物体内发挥重要作用。PRSS35首次发现于小鼠卵巢[8]，有研究显示，PRSS35在小鼠卵泡的发育、排卵过程以及黄体的形成与退化中发挥作用[7-8,10]。

单胎动物牛在发情周期中，一般会出现2～3个卵泡波[17]，当卵泡波发生偏差时，一个卵泡会被选择为DF继续生长，直到卵巢上发生黄体溶解，导致孕酮的分泌减少，随后的LH脉冲频率增加，出现一个LH峰，引起LH/FSH的激增，进而发生排卵反应[18]，其余卵泡均为SF，则停止生长直至闭锁。本试验通过B超超声波确定并成功分离牛DF与SF，qRT-PCR和Western blotting结果显示，牛DF颗粒细胞中PRSS35在mRNA和蛋白水平表达均极显著高于SF(P<0.01)；免疫组化结果显示PRSS35蛋白在牛卵泡的DF与SF颗粒层均有表达。GCs作为卵泡中对卵母细胞有营养作用与重要调节作用的细胞，其增殖与分化常作为卵泡发育的标志[19]。

本试验成功设计PRSS35 siRNA干扰序列，转染GCs，通过细胞培养液E2浓度测定与细胞凋亡计数来研究PRSS35的功能。E2的分泌能力是卵泡的一个重要特征[20]，而E2由卵泡GCs分泌生成，GCs凋亡个数增多时，E2分泌能力会显著下降，卵泡闭锁的最主要原因是GCs的凋亡[21]。如果观察到一个发育卵泡中有10%以上的颗粒细胞发生细胞凋亡，表明该卵泡已经或正在闭锁，且卵泡一旦进入闭锁就不能再回到正常的发育轨道上。因此当E2分泌能力丧失时即发生卵泡闭锁[22]。Fortune[23]对牛 发情周期内各卵泡E2的浓度大小进行了比较分析，发现在发情周期的第5天，DF卵泡液中E2浓度比第3天募集卵泡的浓度要高得多，而第5天的SF卵泡液中E2浓度与第3天的募集卵泡相似。当发生偏差，检测到DF略大于最大SF时，其卵泡液中的E2浓度更高，GCs会分泌更多的E2。DF是与SF相比具有更大的E2分泌能力[24]。因此DF中GCs会继续增殖分化，并通过E2的分泌来维持DF的继续生长发育，为最终的卵泡排卵提供生理基础；而SF中GCs会停止生长，细胞逐步凋亡，最终造成卵泡闭锁。细胞培养液中添加的FSH会促进卵泡GCs增殖与E2的分泌，FSH与GCs上受体结合，通过cAMP信号途径激活芳香化酶从而使得雄烯二酮转化为E2的能力增强。GCs上不光有FSH受体，也有胰岛素受体。在培养液中添加胰岛素可以增强FSH对芳香化酶的刺激作用，增加E2分泌量[25]。沉默PRSS35基因后，可观察到GCs凋亡个数与E2浓度的同步降低，说明PRSS35对GCs的增殖分化起促进作用，在牛卵泡发育过程中起促进作用。

4 结 论

PRSS35在牛DF和SF差异表达，PRSS35基因沉默后，通过抑制牛卵泡GCs增殖，降低卵泡E2分泌，从而调控牛卵泡的生长发育。