云南部分地区猫血巴尔通氏体感染状况的监测

吕 艳，翟国莲，常江艳，石莲琴，元正菊，赵焕云，邹丰才，段博芳*

(1.云南农业大学动物医学院，昆明 650201; 2.云南省动物疫病预防控制中心，昆明 650201； 3.永德县动物卫生监督所，永德 677600； 4.云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224)

猫血巴尔通氏体(Haemobartonellafelis,H.felis)是引起猫传染性贫血的一种血液原虫，主要寄生于猫红细胞表面，该病主要感染猫，呈急性和亚急性慢性发病等。患病动物通常呈现贫血、黄疸、血红蛋白尿等症状，但慢性感染时临床症状不明显[1],主要通过输血、吸血昆虫叮咬或经过卵将病原传播给下一代[2]。1953年Flint和Moss[3]首次报道猫血巴尔通氏体之后，2010年在我国广州地区有猫血巴尔通氏体感染的相关报道[4]。

到目前为止，基于猫血巴尔通氏体16S rRNA基因序列的种系发育鉴定，猫血巴尔通氏体有3个病原株：猫大型血巴尔通氏体(Mycoplasmahaemofelis，Mhf，又叫Haemobartonellafelis，H.felis)、猫小型血巴尔通氏体(CandidatusMycoplasma haemominutum，CMhm)及CandidatusMycoplasma turicensis(CMt)[5-6]。研究发现，猫小型血巴尔通氏体在猫中感染率较高且较为普遍，而猫大型血巴尔通氏体感染率较低且致病性强，CandidatusMycoplasma turicensis感染率及致病性相对较弱[7-8]。针对云南地区猫感染猫血巴尔通氏体的情况尚缺乏报道。

本研究采用PCR扩增猫血巴尔通氏体16S rRNA基因序列，通过序列分析及系统发育进化树的构建，获悉云南地区猫血巴尔通氏体的流行情况，为云南猫中猫血巴尔通氏体病的防治提供理论依据和数据信息。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2016年1月至2017年10月从云南昆明市某宠物医院、玉溪市某宠物医院、版纳州勐腊县、红河州金平县、临沧市沧源县5个地区采集无菌抗凝猫血液样品338份，样品信息见表1。

表1样品信息表

Table1Thesampleinformation

只

1.2 DNA提取

DNA提取参照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作进行(试剂批号：Q5612)，DNA于-20 ℃保存备用。

1.3 猫血巴尔通氏体种类的初步鉴定

采用Jensen等[9]的方法进行PCR扩增，该方法能鉴别区分猫体内感染猫大型血巴尔通氏体(H.helis/Large-form，Mycoplasmahaemofelis)和猫小型血巴尔通氏体(H.felis/Small-form，CandidatusMycoplasma haemominutum)的感染，预计扩增片段大小分别为170和193 bp。引物序列如下，352-F:5′-ACGAAAGTCTGATGGAGCAATA-3′，544-R：5′-ACGCCCAATAAATCCG(A/G)ATAATPCR-3′，扩增体系：总体积25 μL，其中Premix-Taq12.5 μL,引物浓度为50 μmol·L-1，DNA标准模板2 μL，加水至25 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共45个循环；最后72 ℃再延伸5 min。其中阳性对照样品来自于本实验室保存样，阴性对照为无菌水。

1.4 16S rRNA基因的扩增

检测得到的1份猫大型血巴尔通氏体感染根据2014年Aquino等[10]报道的PCR方法扩增，完成猫血巴尔通氏体病原体16S rRNA大于1 000 bp的测序检测，PCR扩增体系：总体积50 μL，其中Premix-Taq25 μL,引物浓度为50 μmol·L-1,猫血巴尔通氏体DNA标准模板5 μL,加水至50 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性 5 min；变性95 ℃ 10 s；退火62 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s进行45个循环，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 电泳与序列分析

取扩增后的PCR产物7 μL，选用DL2000 marker、2%琼脂糖凝胶进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统上观察结果、拍照。将出现预期条带的扩增产物送至生工生物工程有限公司进行双向测序，测序结果经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)核酸比对系统比对。

1.6 生物信息学分析

采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件进行序列拼接与校正，将测得序列与GenBank中公布的猫血巴尔通氏体的16S rRNA标准序列进行比对，采用邻位相连法(neighbor-joining)绘制遗传进化树，分析检获样本的种属关系。同时，使用SPSS22.0完成感染因素分析。

2 结 果

2.1 感染情况

338份样品中，检出猫血巴尔通氏体阳性21个，其感染率为6.21%。其中阳性样品均来自于宠物猫，阳性率为7.98%，电泳图见图1。

2.2 16S rRNA核苷酸序列及系统进化树分析

本试验得到猫大型血巴尔通氏体16S rRNA核苷酸序列，见表2(GenBank登陆号：MH447082)。

M. DNA相对分子质量标准；1～21. 检测样品；+. 阳性对照；-. 阴性对照
M. DL2000 marker; 1-21. Test sample; +. Positive control; -. Negative control
图1 猫血巴尔通氏体16S rRNA PCR产物电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Haemobartonella felis 16S rRNA PCR products

表216SrRNA核苷酸序列信息表

Table216SrRNAnucleotidesequenceinformationtable

位置Position16S rRNA核苷酸序列(5′→3′)16S rRNA nucleotide sequence位置Position1GGGGGCTGGGGCACGGGTGAGTATACATATCTAACATGCCCCTCTGTGGG-GGATAGCCGCTTGAAAAAGCGATTAATACCCCATAGGAAG9091CTTTATCCATGATTTAGCTTTTAAAGCCTTCGGGCGCTGAGGGATTG-GGATATGCTCTATTAGCTAGTTGGCGGGATAAAAGCCCACCAA180181GGCAATGATAGATAGCTGGTCTTAGAGGATGAACAGCCACAATGG-GATTGAGATACGGCCCATATTCCTACGGGAAGCAGCAGTAGGGAA270271TCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCATGTGAACG-ATGAAGGCCTTTTTGGTTGTAAAGTTCTTTTACGAGGGATAATT360361ATGATAGTACTTCGTGAATAAGTGACAGCAAACTATGTGCCAGCAG-CTGCGGTAATACATAGGTCGCGAGCATTATTCGGATTTATTGGG450

(续表2 Continued)

基于猫血巴尔通氏体的16S rRNA种系发育分析，对1例为猫大型血巴尔通氏体(Mycoplasmahaemofelis)样本序列构建进化树，根据邻接法(NJ)建立系统发育树，利用MEGA6.0构建种系发育进化树，进化树见图2。

“▲”表示本研究鉴定的猫大型血巴尔通氏体
Haemobartonella felis isolates identified in this study are indicated by ▲
图2 猫血巴尔通氏体基于16S rRNA基因序列种系发育树
Fig.2 Phylogenetic analysis of Haemobartonella felis isolated from cats based on 16S rRNA gene sequences

2.3 不同养殖模式和不同年龄阶段猫的感染率

被检动物中，市区内宠物猫的感染率为7.98%，农村散养猫中未检出阳性，见表3，不同养殖模式之间差异显著(P<0.05)；根据年龄将检测的样品划分为三个阶段，各年龄阶段均有感染分布，其中小于5月龄，感染率为2.25%(2/89)，6～9月龄，感染率为4.17%(4/96)，10月龄以上，感染率为9.80%(15/153)，各年龄之间差异显著(P<0.05)，见表4。

表3养殖模式与猫血巴尔通氏体感染率的关系

Table3PrevalenceofHaemobartonellafelisindifferentnurturemodelsofcats

养殖模式Nurture models数量/只Samples numberPCR检测 PCR amplification阳性数/只Positive感染率/%Infection rateP值 (95%CI)P-value (95%CI)市区饲养Pet cats of urban263217.98Reference农村散养Rural of free-range75000.014 (0.016～0.143)总计 Total338216.210.003(0.198～0.921)

表4年龄与猫血巴尔通氏体感染率的关系

Table4PrevalenceofHaemobartonellafelisindifferentagesofcats

年龄(月龄)Age (Month)数量/只Samples number阳性数/只Positive感染率/%Infection rateP值 (95%CI)P-value (95%CI)≤58922.25Reference6～99644.170.077 (0.132～0.007)≥10153159.800.002 (0.161～0.035)

3 讨 论

3.1 猫血巴尔通氏体的感染情况分析

已有文献报道猫血巴尔通氏体的感染率与猫的年龄有一定的相关性[11]，本次检测发现各个年龄阶段的猫均有感染，总体感染率为6.21%，其中10月龄以上的猫感染率为9.80%，相对于其他年龄阶段的猫感染率较高。其中感染类型以猫小型血巴尔通氏体为主，这与2004年Tasker等[12]和2005年Willi等[6]报道的结果一致，说明在云南的猫群中猫血巴尔通氏体的感染没有明显的时间及地域差异性。本次试验从猫养殖模式分析中还发现，市区内饲养的宠物猫感染率明显高于农村散养猫，这与2010年庄庆均等[4]对广州地区猫血巴尔通氏体流行病学调查结果不一致，可能原因，本次试验收集农村家养猫的样本代表性不强，另一方面也说明随着宠物猫与人类的关系越来越亲近，提示在猫的圈养中要加强其免疫预防措施。

3.2 猫大型血巴尔通氏体的分子遗传分析

猫大型血巴尔通氏体是引起猫传染性贫血的一类血液寄生虫，扩增得到猫大型血巴尔通氏体近全长的16S rRNA基因序列，该序列与Mycoplasmahaemofelis(GenBank登录号：EU839978)相似性高达98.6%，与感染鼠血巴尔通氏体相似性为86.3%， 测序分析结果与1998年Foley等[13]的分析结果一致，本试验从分子水平上证实了云南地区存在猫大型血巴尔通氏体的感染。

3.3 不同养殖模式和年龄的感染因素分析

本研究采用PCR对来自云南部分地区不同养殖模式的猫血液样品进行了16S rRNA的基因扩增，检出市区内饲养猫感染率为7.98%(21/263)，养殖模式之间感染率有差异，且差异显著(P<0.05)，说明养 殖模式与其感染率关系密切。小于5月龄猫血89份，6～9月龄猫血96份，10月龄以上猫血153份。各年龄阶段均有分布，其中小于5月龄感染率2.25%(2/89)，6～9月龄感染率4.17%(4/96)，10月龄感染率9.80%(15/153)，检测三个年龄段之间的感染率差异性显著(P<0.05)。结果显示猫血巴尔通氏体的感染率与猫年龄大小有着密切关系，年龄越大的猫越容易感染，可能原因随着猫年龄增大其免疫力低下，感染猫血巴尔通氏体的概率增大。

4 结 论

4.1云南部分地区猫血巴尔通氏体的感染以猫小型血巴尔通氏体为主。

4.2本试验对猫血巴尔通氏体16S rRNA测序分析，得到一个猫大型血巴尔通氏体的16S rRNA核苷酸序列，应高度关注这种病原体引起的猫的严重贫血症。

4.3猫对于感染猫血巴尔通氏体与其养殖模式和年龄密切相关。

综上所述，通过对云南部分地区猫的血液样品进行检测，本试验首次报道了云南省部分地区猫血巴尔通氏体的感染情况，揭示了猫血巴尔通氏体在云南的流行，亦为该病的防控提供了支撑数据。