响应曲面法优选香橼配方颗粒挥发油包合工艺*

李雪利，高杰，李哲，常云凤，孙福仁，高晗，李军山，2（.神威药业集团有限公司，河北石家庄05430；2.河北省中药配方颗粒工程技术研究中心，石家庄050200）

香橼为芸香科植物枸橼或香圆的干燥成熟果实，在秋季果实成熟时采收，趁鲜切片，晒干或低温干燥，亦可整个或对剖两半后晒干或低温干燥[1]，分布于江苏、浙江、安徽、江西、湖北、四川等地，多为栽培。香橼味辛、苦、酸，而性温，归脾、肝、肺经，化湿开胃，温脾止泻，理气安胎，具有疏肝理气、宽中、化痰等功效，用于肝胃气滞，胸胁胀痛，脘腹痞满，呕吐噫气，痰多咳嗽。香橼果实中含有多种成分，外层果皮含挥发油，挥发油中主要成分为枸橼醛、苧烯、三萜烯等，另含橙皮苷[2]。目前，香橼配方颗粒生产过程中挥发油为手工喷壶加入，该方法存在溶油耗时、加入不均匀及花粒等问题，同时中间产品储存过程中及包装后随储存时间的延长，挥发油会慢慢挥发而造成损失。为解决香橼挥发油加油难及加入后的稳定性等问题，特展开香橼挥发油β-环糊精（β-CD）包合工艺的探索研究。本研究采用响应曲面法，以挥发油包合率及包合物收率为考察指标，以挥发油与β-CD比例、包合温度、包合时间为影响因素，确定香橼配方颗粒挥发油包合工艺[3-6]，为工业化生产提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料 香橼挥发油（批号：170922，神威药业集团有限公司）、95%乙醇（分析纯，批号：20170218，天津市申泰化学试剂有限公司）、β-CD（批号：160807，安徽山河药用辅料股份有限公司）。

1.2 主要仪器 EMS-20磁力搅拌水浴锅（金坛市仪都仪器有限公司）、CPA225D分析天平（赛多利斯）、JMA5002电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）、水循环真空泵（上海申生科技有限公司）、DHG-9140A热风循环鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司、太仓精宏仪器设备有限公司）、LC-20AT高效液相色谱仪（岛津仪器设备有限公司），KH3200E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 香橼配方颗粒挥发油的提取 取香橼饮片150kg，加入7倍量的水，保持微沸状态水蒸气蒸馏，提取至挥发油不再流出，得到油水混合物；将得到的油水混合物放入4℃的冷藏库内放置24 h，使油水自然分层，分离回收挥发油层，即得。

1.3.2 香橼配方颗粒挥发油包合物的制备 （1）香橼配方颗粒挥发油乙醇溶液的制备：取香橼配方颗粒挥发油加入等量95%乙醇（V：V）进行溶解，混合均匀后备用。（2）β-CD饱和水溶液的制备：称取各实验方案中规定量的β-CD，加入处方量的纯化水，在各方案规定的温度下制成饱和水溶液，保温，备用。（3）香橼配方颗粒挥发油包合物的制备：将制备好的β-CD饱和水溶液置于EMS-20磁力搅拌水浴锅内，按各实验方案设定的包合条件进行包合，将香橼配方颗粒挥发油乙醇溶液缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，待挥发油乙醇溶液全部加入后开始计时，继续搅拌至规定时间，放至室温，4℃冷藏24 h，抽滤，用无水乙醇20 mL洗涤3次，置热风循环鼓风干燥箱内，45℃干燥5 h。

1.3.3 包合物收率及挥发油包合率的测定 （1）包合物中挥发油含量测定。按中国药典2015版中挥发油测定法甲法，精密称定上述香橼挥发油的干燥包合物，置于烧瓶中，放入沸石适量，加水300 mL，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管，置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸至测定器中的油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端达到刻度0线上面5 mm处为止，放置1 h以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰好与刻度0线平齐，读取挥发油量，计算供试品中挥发油含量。（2）挥发油空白回收率测定。精密量取挥发油1.00 mL，β-CD 12 g，在与（1）相同条件下测定挥发油的体积，计算空白回收率。（3）β-CD与纯化水比例的影响。称取β-CD 5 份，各 15 g，分别加入 90、120、150、180、210 g纯化水，置磁力搅拌水浴锅内，40℃制成饱和水溶液，将香橼配方颗粒挥发油1 mL与95%乙醇溶液1 mL混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，搅拌2 h，放冷，冰箱冷藏24 h，抽滤，用无水乙醇20 mL洗涤3次，45℃干燥5 h。（4）挥发油与β-CD比例的影响。同（3）称取β-CD加入150 g纯化水后制成饱和水溶液，分别将香橼配方颗粒挥发油 2、1.5、1.2、1、0.75 mL 与等量 95% 乙醇溶液混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中后同（3）处理。（5）包合时间的影响。同（3）称取 β-CD 加入 150 g纯化水后制成饱和水溶液，将香橼配方颗粒挥发油1 mL与等量乙醇溶液混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，分别搅拌 1、2、3、4、5 h 后同（3）处理。（6）包合温度的影响。称取β-环糊精5份，各15 g，加入150 g纯化水，置磁力搅拌水浴锅内，分别于 30、40、50、60、70℃制成饱和水溶液，将香橼配方颗粒挥发油1.5 g与等量乙醇溶液混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中后同（3）处理。

1.3.4 评价指标 以挥发油包合率和包合物收率的综合评分为考察指标，两个指标的权重为6：4，挥发油包合率=包合物实际含油量/挥发油空白回收率/投油量×100%，包合物收率=包合物重量/（β-CD重量+投油量）×100%，综合评分=（挥发油包合率/挥发油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40[7-8]。

1.4 统计学处理 利用Design-Expert8.0.5软件进行试验设计，对综合评分结果进行二次多元回归拟合和方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 挥发油空白回收率测定结果 实验3次，其值分别为90.00%、93.00%、92.00%，平均值为91.67%，相对标准偏差（RSD）为1.67%。

2.2 单因素考察试验结果 测定挥发油包合率及包合物收率时，β-CD与纯化水比例为1∶10时综合评分最高，见图1；挥发油与β-CD比例为1∶15综合评分最高，见图2；包合时间为4 h，综合评分最高，见图3；包合温度为40℃时综合评分最高，见图4。

图1 β-CD与纯化水比例

图2 挥发油与β-CD比例

2.3 香橼配方颗粒挥发油包合工艺优选 在单因素试验的基础上，应用响应曲面法对香橼配方颗粒挥发油的β-CD包合工艺进行优化。以挥发油与β-CD比例（A）、包合温度（B）、包合时间（C）为考察因素，每个因素选择3个水平，响应曲面试验因素水平编码见表1。

2.4 响应曲面试验结果分析 本试验共含有17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点。Box-Behnken试验设计及结果见表2，回归模型和方差分析见表3。对综合评分结果进行二次多元回归拟合，回归方程Y=95.78+7.20A-4.68B+2.21C-1.68AB-1.28AC-0.82BC-3.49A2-11.42B2-7.29C2，调整后相关系数为 0.9927，所建模型与试验拟合较好。该模型具有显著水平，足以拟合试验数据，失拟项不显著，说明试验误差小、可信度高，可以用于香橼配方颗粒挥发油β-CD包合工艺的分析和预测。

图3 包合时间的影响

图4 包合温度的影响

表1 响应曲面试验因素水平编码

2.5 各因素间相互作用对结果的影响 由方差分析结果可以看出，A、B交互效应显著，A、C和B、C交互效应不显著，等高线图及效应曲面图见图5。从综合评分考虑各个因素的影响程度大小为：A＞C＞B。

2.6 响应曲面优化香橼配方颗粒挥发油β-CD包合工艺条件 最优干燥工艺为：挥发油与β-CD比例为1：16.23；包合温度为39℃；包合时间为3.85 h。在此工艺条件下，综合得分为98.104分。在优选出的最佳工艺条件下进行验证试验（n=3），得到包合物收率为75.64%，挥发油包合率为90.97%，综合得分为97.36分，RSD为1.4%。实践结果与模型预测值基本一致。

3 讨 论

3.1 本研究通过单因素试验和响应曲面分析对香橼配方颗粒挥发油β-CD包合工艺进行优化，得到挥发油与β-CD比例、包合温度、包合时间对包合物收率、挥发油包合率的回归模型，经分析所建模型有效。该方法客观合理的评价了香橼配方颗粒挥发油β-CD包合过程，避免因主观因素对试验结果造成误差，最终确定了最佳包合工艺。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

表3 回归模型和方差分析

3.2 由于挥发油性质不稳定、易挥散、具有刺激性、溶解性差，故成药性差，将CD与挥发油包合后，可增加药物的稳定性、减少挥发油的挥发、掩盖不良气味、增加挥发油的溶解度[9-14]，利于有效成分的稳定和保存[15-19]。因此，CD包合技术被广泛用于挥发油的制剂过程。但目前CD与挥发油的包合研究应用于中药配方颗粒尚未见报道。本研究对香橼配方颗粒挥发油β-CD包合工艺进行了研究，打破中药配方颗粒制备过程中挥发油传统的加入方式，增强了药物的稳定性及服药适应性[20]。但改变挥发油加入方式对产品药理作用产生的影响尚待进一步研究。

图5 等高线和响应面图