HPV-16型在膀胱尿路上皮细胞癌人群中的表达及临床意义

马榕 黄如 郭帅 周政 浦金贤 赵晓俊

在中国，膀胱尿路上皮细胞癌(uroepithelium cell carcinomas of the bladder, BUCC)居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤发病率第一位，全部恶性肿瘤发病率第八位，已确定的危险因素包括吸烟和暴露于芳香胺、电离辐射和环磷酰胺[1]。近年来,有文献报道BUCC的发病与人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染有关[2]。HPV，尤其是其中的16型，已被证实在人上皮细胞肿瘤中起重要作用[3]。HPV感染直接或间接导致了约10%的人类肿瘤形成[4]。部分研究认为HPV与BUCC的发生有密切关系，并影响其病理分级[5-6]；而部分研究则认为HPV与BUCC的发生和发展无明显相关性[7]。本研究对BUCC及对照组患者膀胱组织中HPV-16型的感染状况进行了检测，旨在明确高危型HPV-16型与BUCC的关系。

对象与方法

一、组织标本的收集

本实验标本均取自2014年9月至2017年12月于我院泌尿外科就诊的患者，其中实验组标本(70例)取自病理确诊为BUCC的患者，对照组标本(60例)取自因结石行膀胱镜或输尿管镜检查的患者。所取标本离体后尽快装入EP管并立即转入-80 ℃ 冰箱内保存。每个标本均用福尔马林固定，病理诊断由我院病理科医师完成。本研究获得医院伦理委员会批准，且患者及其家属均知情同意。

二、实验方法

1.抽提DNA:取细胞悬液，离心后用基因组提取试剂盒提取 DNA，按试剂盒中的操作说明严格进行各步骤，最后将DNA浓度统一稀释成100 ng/μl，存放于-20 ℃ 的设备中。

2.PCR扩增：使用引物核苷酸序列：HPV-16(1)，5′-AAGGCCAACTAAATGTCAC-3′；HPV-16(2)，5′-CTGCTTTTATACTAACCGG-3′，片段长度为 217 bp。反应总体积25 μl，含10×PCR缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2]2.5 μl、2.5 mmol/L dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)0.5 μl、10 pmol/μl引物各0.5 μl、TaqDNA聚合酶0.15 μl(5 U/μl)以及cDNA模板100 ng，加无菌ddH2O补到25 μl。反应条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30个循环后最后72 ℃延伸10 min。

3.PCR产物琼脂糖凝胶电泳：取10 μl PCR 产物做1.0% 琼脂糖凝胶电泳，以天能凝胶成像系统拍摄处理。

4.结果判定：若在217 bp 处出现明亮条带，和预判结果相符，表明HPV-16 DNA阳性，产物经过电泳分析后进行测序验证。见图1。

三、统计学方法

使用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，计数资料以率(%)表示，运用卡方检验和95%置信区间进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。

M:D2000 Marker;1:HPV-16感染组织;2:阴性对照

图1 电泳结果判定

结 果

对照组与实验组病例的性别及年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，实验组吸烟人数与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而与饮酒无显著关联(P>0.05)。患者临床一般资料见表1。

PCR结合凝胶电泳方法检测结果显示，HPV-16在实验组中的表达(15.7%)和对照组中的表达(13.3%)无统计学差异(P>0.05)，并且与患者的年龄及肿瘤分化程度无关(P>0.05)。见表2。

表1 两组患者临床一般资料比较[n(%)]

表2 HPV-16的表达与年龄及肿瘤分化程度之间的关系[n(%)]

讨 论

HPV属乳多空病毒科DNA病毒，HPV的基因组是双链闭环，目前认为口腔乳头状瘤、尖锐湿疣一般是由HPV-6和HPV-11引起的[2]。口咽鳞癌和癌前病变主要是由HPV-16和HPV-18感染导致，在宫颈鳞癌的患者中，约有50%感染HPV-16和(或)HPV-18[8-9]。近年来有研究发现，泌尿生殖系统肿瘤的HPV感染率较高，尤其是HPV-16感染[10-12]。本课题组前期研究发现，HPV感染与前列腺癌的发生有一定的相关性[13-15]。

关于膀胱癌与HPV的相关性，研究结论存有争议，Shaker 等[16]研究显示，BUCC高危型 HPV-16/18 阳性率明显高于慢性膀胱炎和正常膀胱组织，且与膀胱癌患者的临床分期具有一定的相关性。Polesel等[17]对尿液中的HPV进行了检测，结果显示HPV与膀胱癌无明显相关性。Schmid等[7]对中欧人群样本进行了前瞻性研究，研究结果表明HPV感染与膀胱癌的发生和发展无相关性。

本研究主要应用PCR结合凝胶电泳的方法对BUCC病例组及对照组膀胱组织中的HPV-16进行了检测。数据分析显示，BUCC病例组和对照组中HPV-16的检出率相差无几，且检出率都较低，因此，我们认为HPV-16感染与BUCC无显著相关性。并且，在BUCC病例组中，不同年龄段和不同肿瘤分化程度标本的HPV-16感染率也无明显差异。通过对患者生活习惯的调查，我们发现吸烟与BUCC患病有明显相关性，但与饮酒无明显关联。

本研究使用的HPV-16检测方法，即PCR结合凝胶电泳，是目前最敏感的检测HPV病毒的方式之一[18]。本研究认为，一般情况下无论是正常膀胱组织，还是BUCC患者的肿瘤组织，HPV-16的感染率均较低，BUCC的发生与HPV-16感染无关。