吡格列酮调控离体新生大鼠心肌细胞增殖与肥大的研究

哺乳动物胚胎期心脏发育既有心肌细胞的增殖也有心肌细胞体积的增大，而出生后心肌细胞基本丧失了增殖能力，仅表现为细胞体积的增大[1-4]。同时哺乳动物出生后心脏的成熟过程中，心肌细胞的能量来源由葡萄糖代谢为主转变成脂肪酸代谢为主[4]。有研究提示出生后心肌细胞增殖能力的改变可能与过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）相关[4-5]。而降糖药吡格列酮的主要作用是激动PPAR-γ促进前脂肪细胞分化为脂肪细胞和维持葡萄糖代谢和体内平衡[6]。本研究推测，吡格列酮可能对新生大鼠心肌细胞的增殖能力存在某种影响，且目前尚未有相关的报道。

因此，本研究旨在探讨吡格列酮是否参予新生大鼠心肌细胞（neonatal rat cardiac myocytes，NRCM）的增殖和肥大，为研究出生后心肌细胞增殖与肥大的机制提供一些新的线索。

1 方法与步骤

1.1 原代新生大鼠心肌细胞提取与培养

参照已发表文献中的方法进行新生大鼠心肌细胞提取与培养，且提取的心肌细胞经过密度梯度离心法进行了纯化，去除了其中大部分的成纤维细胞与血细胞[7-9]。

1.2 细胞加药处理

原代新生大鼠心肌细胞正常培养48 h后，用无血清的培养基饥饿处理过夜，然后将饥饿培养基吸掉一半，再将配制好的吡格列酮溶液加入到已经饥饿处理过的心肌细胞中，摇匀，培养48～72 h。

1.3 细胞增殖的检测

1.3.1 EDU染色 向加药处理的NRCM中加入配制好的EDU溶液，培养24小时，然后进行细胞固定与EDU染色标记[8]。

1.3.2 免疫荧光染色 将加药处理的NRCM先固定好，然后加入相应的一抗孵育过夜，再加入对应的荧光二抗，最后进行DAPI染色标记细胞核[8]。

1.3.3 拍照 在免疫荧光显微镜下对已经完成染色的心肌细胞进行分别拍照。

1.3.4 计数 分别计数心肌细胞总数和增殖心肌细胞数。

1.4 统计学方法

本实验主要的统计方法是非配对t检验和χ2检验，采用SPSS 20，GraphPad和Image J统计软件进行统计分析，以P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EDU染色结果比较

在NRCM培养基中加入10 μmol/L吡格列酮，培养48 h后，EDU染色（见图1A和图1B），统计分析提示：吡格列酮组NRCM的EDU阳性细胞比例高于对照组（Con）, 差异具有统计学意义（P=0.000 6）（见图1C）。

图1 两组细胞增殖率与细胞大小比较

2.2 Ki-67染色结果比较

在NRCM培养基中加入10 μmol/L吡格列酮，培养48 h后，Ki-67免疫荧光染色（如图1E和图1F），统计分析提示：吡格列酮组NRCM的Ki-67阳性细胞比例高于对照组，差异具有统计学意义（P=0.034 7）（如图1G）。

2.3 NRCM细胞大小比较

使用Image J软件统计平均NRCM细胞大小，结果显示吡格列酮组的NRCM细胞大于对照组，差异具有统计学意义（P=0.008 5）（如图1D）。

3 讨论

心脏发生病理性肥厚时，仅有心肌细胞的肥大而没有心肌细胞的增殖，表现为心肌细胞内肌纤维的增大增粗，线粒体数量的增多和功能的增强[10]。但这种线粒体的代偿远不足以满足肥大的心肌细胞的需求，即表现为心肌细胞的损伤和凋亡，继而发展为心功能失代偿最终进展为心衰[10]。有研究表明耐力运动等诱导的生理性心脏肥大，既有心肌细胞的肥大也有心肌细胞数量的增多[11-12]。Duan SZ等发现心脏特异性PPAR-γ敲除的小鼠会发生心室肥厚和轻度的心功能损害[13]。这可能是由于PPAR-γ的降低导致了参与脂肪酸氧化的蛋白表达下降，继而由脂肪酸的利用下降促发了心脏病理性肥厚的发生。而在本实验中发现吡格列酮（PPAR-γ激动剂）会促进NRCM的增殖和肥大，提示吡格列酮可能与心脏的生理性肥大相关，对病理性肥大有拮抗作用。但是在我们的体外细胞实验中，吡格列酮是通过什么机制来促进心肌细胞肥大和增殖尚不清楚。大多数的研究表明吡格列酮抑制肿瘤细胞增殖（胃癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等），在少部分肿瘤（膀胱癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤）中则表现为促进肿瘤细胞增殖[14]。借鉴于吡格列酮与其他细胞增殖的研究以及心肌细胞增殖调控的研究，本研究下一步的工作就是寻找吡格列酮在心肌细胞中的作用靶点及作用机制和吡格列酮在体内与心肌细胞增殖及肥大的关系。

本研究发现吡格列酮可以促进心肌细胞的增殖并促进心肌细胞的肥大，这就提示吡格列酮可能与心脏的生理性肥厚可能存在一定的关系，并可能对病理性肥厚起到保护作用。吡格列酮的这一作用有可能为病理性心肌肥大的治疗提供新的研究方向。