周冬冬 刘晶晶 史振东 杨茜曦 张 瑾
(天津医科大学肿瘤医院乳腺三科,天津 300060)
三阴性乳腺癌既不表达雌激素和孕激素受体,也不表达人表皮生长因子受体-2,是乳腺癌的一个特殊亚型,占乳腺癌的10%~20%,具有恶性程度更高、侵袭能力更强、预后更差的特点,且对人表皮生长因子受体-2的曲妥珠单抗分子的靶向治疗无效〔1,2〕。微小RNAs(miRNAs)是一类非编码单链的小分子RNA,能够通过与目标mRNA结合直接降解mRNA或抑制其翻译等机制发挥调控细胞发育、增殖等功能,在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用〔3,4〕。miR-21、-200a、-200b均是调控细胞发育、增殖的重要miRNAs,但目前有关三者血清水平在老年三阴性乳腺癌中临床意义的报道较少。本研究通过探讨血清miR-21、-200a、-200b水平在老年三阴性乳腺癌患者中的临床意义,为其诊疗提供参考。
1.1对象 2014年1月至2017年12月天津医科大学肿瘤医院接受治疗的80例经病理学确诊为乳腺癌(雌激素和孕激素受体及人表皮生长因子受体-2表达均阴性)、年龄60~78岁、平均(65.3±7.6)岁的老年三阴性乳腺癌患者为观察组,同时选择50名年龄60~76岁、平均(66.2±8.4)岁的健康体检者为对照组。观察组浸润性导管癌52例、浸润性导管癌28例。
1.2主要试剂与仪器 Trizol试剂盒、miRNA反转录试剂盒及荧光实时定量试剂盒分别购于美国Invitrogen公司、德国QIAGEN公司和日本Takara公司;miR-21引物:5′-tagcttatcagactgatgttga-3′;miR-200a引物:5′-taacactgtctggtaacgatgt-3′-miR-200b引物:5′-taatactgcctggtaatgatga-3′、下游通用引物和内参U6引物均由试剂盒提供。紫外分光光度计Ultrospec与荧光实时定量仪分别购于美国GE Healtbcare公司和BioRad公司。
1.3RNA的提取 于清晨抽取两组对象静脉血5 ml,离心,分离血清,按照Trizol试剂盒说明书提取RNA:取0.5 ml分离好的血清,加入0.5 ml Trizol,于室温下静置10 min;加入0.5 ml氯仿,混匀,于低温下12 000 r/min离心10 min,吸取上层透明液体,加入0.75倍上层液体量的异丙醇,混匀后,于低温下12 000 r/min离心10 min,沉淀加入1.0 ml乙醇洗涤后,于低温下12 000 r/min离心5 min,置室温下干燥15 min;加入无RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解,用紫外分光光度计进行定量后,保存于-80℃冰箱。
1.4miRNA cDNA反转录及荧光实时定量 按照试剂盒说明书进行操作:取出提取好的RNA,配制成体积为20 μl的反应体系;反应条件为:37℃反转录反应60 min,95℃灭活反应5 min;取出反转录产物,配制成体积为20 μl的反应体系,将其放置于荧光定量仪中进行反应,95℃预变性反应15 min,94℃变性反应15 s,55℃退火反应30 s,70℃延伸反应30 s,40个循环。用2-△ct计算相对表达量。
1.5统计学分析 采用统计学软件SPSS19.0进行t检验。
2.1两组血清miR-21、-200a和-200b水平的比较 与对照组比较,观察组血清miR-21、-200a水平显著升高,miR-200b水平降低(P均<0.01),见表1。
表1 两组血清miR-21、-200a和-200b水平的比较相对表达量)
2.2不同临床病理特征老年三阴性乳腺癌患者血清miR-21、-200a和-200b水平的比较 与中、高度分化、Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移的老年三阴性乳腺癌患者比较,低分化、Ⅲ~Ⅳ期和有淋巴结转移的老年三阴性乳腺癌患者血清miR-21、-200a水平显著升高,miR-200b水平显著降低(P均<0.01),见表2。
表2 不同临床病理特征老年三阴性乳腺癌患者血清miR-21、-200a和-200b水平的比较相对表达量)
因三阴性乳腺癌恶性程度高、侵袭能力强、预后差,因此给女性健康及生命带来了严重的威胁〔5,6〕,早期发现、早期治疗对其预后具有重要意义。目前,miRNAs在调控肿瘤发生、发展和预后方面的作用已经得到证实〔7〕,是肿瘤研究的热点之一。miR-21是在人体组织和细胞中较早发现的微小RNA分子,由单个基因编码,在多种非实体瘤(如淋巴瘤等)和实体瘤(如胃癌、肝癌、肺癌等)肿瘤组织中高水平表达,是第一个在肿瘤患者血清中检测到的微小RNA分子,其可以通过抑制程序性细胞死亡基因(PDCD)4、原肌球蛋白1基因(TPM1)、磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)、转录激活基因(TAP)63等肿瘤抑制基因表达而促进肿瘤细胞的增殖,并与肿瘤的侵袭、转移等病理过程密切相关〔8,9〕。李强等〔10〕研究显示,高水平表达的miR-21会降低肿瘤化疗的敏感性,增加耐药性;而抑制miR-21的表达,能够逆转化疗药物耐药性,提高化疗效果。miR-200a是miR-200家族中的成员之一,其在卵巢癌、胰腺癌等肿瘤组织中高水平表达,被认为是上皮细胞分化和上皮间质转化过程中的关键调控因子,与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关〔11,12〕。miR-200b是miR-200家族中研究较多的一个微小RNA分子,在多种肿瘤中表现出一定的抗肿瘤作用,而且能够抑制肿瘤的侵袭转移〔13,14〕。陈志凯等〔15〕研究发现,胃癌患者血清miR-200b水平显著降低,并与肿瘤的临床分期及淋巴结转移相关,有助于判断疾病的预后。
本研究结果表明老年三阴性乳腺癌患者血清miR-21、-200a及-200b水平的高低与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移密切相关,均可作为三阴性乳腺癌严重程度及预后的判断指标,为其诊疗提供参考。