内蒙古汉族人群硒蛋白S基因rs34713741多态性与大肠癌发病风险的关系

邢少姬 康茹雪 张 萱 王殿栋 郑连生 张亚琼 何 珊

(包头医学院医学技术学院，内蒙古 包头 014060)

大肠癌(CRC)在我国城市和农村发病率分列所有恶性肿瘤的第3、5位，病死率分别居第4、5位〔1〕。现已明确，遗传和环境因素相互作用是导致CRC发生的主要原因，其中，环境因素是导致肿瘤发生的始动因素，个体遗传特征则决定肿瘤的易感性。硒蛋白(Sel)S是一种内质网及细胞膜驻留蛋白。目前研究发现，SelS具有广泛的生物学功能，能清除过氧化物，保护细胞免遭氧化物损伤，抑制和调节炎症和免疫反应，在维持细胞DNA和蛋白质的稳定中发挥重要作用等〔2，3〕。近年来，国内外的一些研究发现，SelS基因多态性与胃肠道恶性肿瘤的发生密切相关〔4～7〕，但尚未见内蒙古地区汉族人群的相关报道。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测CRC患者的SelS基因多态性，探讨内蒙古汉族人群CRC发病风险与SelS基因多态性的相关性。

1 资料和方法

1.1一般资料 2015年7月至2016年10月包头市肿瘤医院、包头医学院第二附属医院经组织病理学确诊的新发CRC患者126例(CRC组)，男73例，女53例，年龄39～79〔平均(61.81±12.55)〕岁，均无放、化疗史，无胃肠道遗传病史。对照组来自同期社区健康体检人群135例，男85例，女50例，年龄35～80〔平均(60.07±10.42)〕岁，经询问病史、体检和各项实验室检查排除其他胃肠道遗传病、糖尿病、冠心病及高血压等其他疾病。入选对象均为汉族，已在内蒙古地区居住10年以上，彼此无血缘关系。CRC组和对照组在年龄、性别上差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要试剂和仪器 基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，引物(上海生工生物工程股份有限公司)，PCR扩增试剂盒和100 bp DNA Ladder Marker(北京天根生化科技有限公司)，限制性内切酶HinfI(英国NEB公司)。UV-160分光光度计(日本岛津制作所)、高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，PCR仪C1000 TouchTM Thermal Cycler及凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad 公司)。

1.3基因组DNA的提取与引物合成 采集研究对象空腹静脉血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，试剂盒提取外周血基因组DNA，用UV-160分光光度计测定DNA浓度和纯度，-20℃保存。SelS基因rs34713741多态位点引物序列参考文献〔6，7〕，上游序列：5′-CTTCCGGTGCGCTCCTAC-3′，下游序列：5′-GGCGACCACTGACTTCCTT-3′，扩增目的基因长度为 302 bp。在Pubmed-SNP数据库中查询SelS基因rs34713741位点两侧基因序列(NC_000015.10)的准确性，并通过BLAST 软件验证引物的特异性。

1.4PCR扩增 PCR扩增反应体系为25 μl，其中含6 μl模板(约100 ng)，上、下游引物各1 μl(10 μmol/L)，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix，4.5 μl去离子水。PCR扩增反应参数：预变性95℃、5 min，变性95℃、30 s，退火62℃、30 s，延伸72℃、1 min，35个循环，最后延伸72℃、5 min。

1.5基因分型及测序 酶切反应体系为20 μl，其中包括PCR扩增产物12 μl，HinfI内切酶2.0 μl，10×限制性内切酶缓冲液2.0 μl，去离子水4.0 μl。37℃水浴30 min后，酶切产物于2.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像分析系统分析其基因型(TT型为302 bp 1个片段；CT型为302 bp、198 bp、104 bp 3个片段；CC型为198 bp、104 bp 2个片段)。为验证分型的准确性，随机选取50例PCR产物纯化后送上海美吉生物北京实验基地测序验证。

1.6统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行χ2检验、Fisher确切概率法、非条件Logistic回归模型。

2 结 果

2.1SelS基因rs34713741多态位点分型及测序结果 SelS基因rs34713741位点存在2个等位基因C和T，组成CC、CT、TT 3种基因型(见图1)。且测序结果与酶切结果完全一致(见图2)。

M：100 bp DNA Ladder Marker；1、3：TT型；4、5、7：CT型；2、6：CC型图1 SelS基因rs34713741 RFLP基因分型电泳结果

A为CC型；B为CT型；C为TT型；横线部分为内切酶HinfI识别位点，箭头所指为SelS基因rs34713741位点碱基图2 SelS基因rs34713741位点PCR产物测序结果

2.2SelS基因rs34713741位点多态性与CRC发病风险的关系 研究人群SelS基因rs34713741位点频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所选样本具有群体代表性(χ2=0.017，P>0.05)。CRC组和对照组CC、CT、TT基因型分布频率、等位基因C、T分布频率均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 两组SelS基因rs34713741位点基因型、等位基因分布〔n(%)〕

2.3SelS基因rs34713741位点多态性与不同临床特征的关系 远端大肠组和对照组的CC、CT、TT基因型分布频率比较差异有统计学意义(P<0.05)，远端大肠组CC基因型分布频率明显低于对照组，携带T等位基因的CT和(或)TT个体患CRC的风险是CC基因型个体的1.719倍(OR=1.719，95%CI：1.144～2.582)。近端大肠组、高、中、低分化组中CC、CT、TT基因型分布频率与对照组比较均无统计学差异(均P>0.05)。提示SelS基因rs34713741位点多态性影响远端CRC的发病风险，但与肿瘤分化程度无关联。见表2。

表2 SelS基因rs34713741位点多态性与不同临床特征的关系〔n(%)〕

1)与对照组比较：P<0.05

3 讨 论

硒是哺乳动物及人体必需的微量元素之一，主要以硒代半胱氨酸的形式存在于蛋白质中。SelS的主要生物学功能有：保护细胞免受活性氧损伤的抗氧化功能，参与炎症反应，参与内质网应激及相关蛋白降解，参与脂蛋白代谢、精子发育等〔8，9〕。SelS的基因定位于15q26.3，包含6个外显子和5个内含子，是由1 250和1 292个碱基组成的两个转录变体，最终的编码产物均为189个氨基酸残基组成的SelS，其中第188位为硒代半胱氨酸残基〔10〕。因此，一旦SelS基因发生突变，可能导致其编码产物发生变化，进而影响抗氧化损伤、抗炎症反应等正常生物学功能，降低人体细胞抵御恶性肿瘤发生的能力。总结目前国内外的相关研究发现，与胃肠道恶性肿瘤密切相关的Sel基因多态性位点多位于基因的启动子区，该处基因的变异相比于编码区对Sel表达的影响更大，更易改变个体罹患肿瘤的风险〔11〕。目前已发现SelS基因至少存在15个多态性位点，但研究最多的是位于基因启动子区的rs28665122和rs34713741位点。如日本Shibata等〔12〕发现，SelS基因rs28665122位点多态性与日本人群胃癌的遗传易感性具有相关性，A等位基因的个体与GG基因型的个体相比，患胃癌的风险显著增高。Meplan等〔5〕研究发现捷克人群SelS基因rs34713741位点多态性与结直肠癌的发病具有相关性，TT基因型个体的患病风险是CC基因型个体的1.68倍。张龙等〔6〕、毛华杰等〔7〕在针对SelS基因rs34713741位点多态性与胃肠道癌症遗传易感性的相关研究中发现，SelS基因rs34713741位点多态性与CRC和胃癌的发病均有关，癌症组CC基因型分布频率明显低于健康对照组，T等位基因可能是中国人群胃肠癌发病的危险因素之一。

本研究提示SelS基因rs34713741位点多态性与CRC的发病风险无相关性，与远端CRC的发病具有相关性，T等位基因可能是内蒙古汉族人群远端CRC发病的危险因素，这与张龙等〔8〕等报道湖南汉族的结果基本一致，但同时也存在差异，湖南汉族人群SelS基因rs34713741位点多态性与CRC发病有关，携带T等位基因的个体患CRC的风险是CC基因型个体的1.597倍(OR=1.597，95%CI：1.096～2.326)，且在远侧CRC组此风险增加，是CC基因型的1.617倍(OR=1.617，95%CI：1.060～2.466)。这可能与不同地区被研究人群的遗传背景不同有关。另外，本研究由于所涉样本例数有限，易出现偏倚。在后续的研究中需继续增加样本例数进行分析。此外，基因间的相互作用及与环境危险因素的协同作用均对肿瘤的患病风险有较大影响〔13〕。因此，还需继续研究基因间及基因与环境间的交互作用。