硫化氢通过调控Bcl-2/Caspase-3的表达减轻糖尿病大鼠心肌细胞凋亡和纤维化

刘茂军 梁 彪 李子宁 江振涛 吴志雄 褚 春 杨 军

(南华大学附属第一医院老年医学科，湖南 衡阳 421001)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病众多慢性并发症中的一类独立于瓣膜性心脏病、冠心病、先天性心脏病、高血压心脏病等疾病之外的特异性心肌病变，是糖尿病的一种严重的心血管并发症〔1〕。很多证据显示其发病机制与氧化应激、细胞凋亡、内质网应激、自噬作用有关〔2〕，但具体发病机制尚未完全明确。研究表明，高血糖是DCM发生发展的核心，它触发了一系列相关下游信号引起心肌细胞凋亡、心室扩大和心脏功能障碍〔3〕，而心肌纤维化是DCM的一种重要病理改变。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，研究显示其在DCM的发生发展过程中起着重要作用〔4〕。而细胞凋亡的过程受一系列基因和蛋白，包括Caspase-3和Bcl-2等的调控。硫化氢(H2S)作为一种新型气体信号分子，它可以通过舒张血管、抗细胞凋亡、抗氧化应激、抗炎症反应等机制在心血管系统中发挥一定的心肌保护作用〔5〕。H2S已发现可以改善糖尿病心肌纤维化的发生发展过程，但有关机制目前所知尚少。本实验观察H2S对糖尿病大鼠心肌纤维化及细胞凋亡和凋亡相关调控蛋白Bcl-2/Caspase-3的表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 成年清洁雄性SD大鼠50只，体重(300±20)g，购自长沙东创动物中心，所有大鼠在(23±1)℃恒温的清洁环境中分笼饲养，人工照明，白天夜黑各12 h，所有大鼠可自由获得食物和水。

1.2主要实验试剂 抗 β-actin 抗体和抗兔二抗采购于美国Proteintech公司；抗 Bcl-2 抗体和抗酶切Caspase-3 抗体购于美国Cell Signaling公司；兔源Ⅰ型胶原蛋白和兔源Ⅲ型胶原蛋白购于中国博士德公司；BCA试剂盒和细胞裂解液采购于中国碧云天生物公司。硫氢化钠(NaHS)试剂购买于美国Sigma公司。

1.3实验动物分组和糖尿病大鼠模型的建立 首先，适应性喂养SD大鼠1 w,然后随机分为5组，每组10只：正常对照组(Control组)、糖尿病组(模型组)、低浓度保护组 (c1组)、高浓度保护组 (c2组)、H2S对照组(H2S组)。模型组、c1组和c2组大鼠按照鼠的体重(40 mg/kg)腹腔注射STZ；注射后24 h之内给予5%葡萄糖水供其饮用预防大鼠发生低血糖休克；注射后72 h，通过尾静脉采血的方法测量血糖，如果血糖大于16.7 mmol/L证明成功建立糖尿病大鼠模型。成功造模后，对照组每天腹腔注射生理盐水；c1组每天按体重注射相应的NaHS溶液(30 μmol/kg)，c2组与H2S组每天按照体重注射相应的NaHS溶液(100 μmol/kg)。实验共持续8 w。

1.4Masson 染色观察大鼠心脏组织纤维化程度 取甲醛固定的心脏组织；石蜡包埋，切片成5 μm厚，切片后常规脱蜡至水。放入Bouin固定液，37℃温箱内作用2 h，然后用流水冲洗至黄色消失，Weiger铁苏木素染5～10 min，流水稍洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟后丽春红酸性品红液染5～10 min，1%磷钼酸水溶液处理5 min，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min，无水酒精脱水3次，每次5～10 s，二甲苯透明3次，最后用中性树胶封固，显微镜下观察。

1.5免疫组化检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维 取甲醛固定的大鼠左心室心肌组织，石蜡包埋，切片成5 μm厚，切片后脱蜡至水，水中煮沸；取出切片后用蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，去除血清；滴加1∶50比例稀释的一抗工作液，PBS冲洗3次，每次5 min。孵育二抗，37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，每次5 min。显色剂进行显色，然后苏木精复染，中性胶封片，显微镜下观察，使用Image Pro Plu软件计算棕色面积比。

1.6TUNEL染色观察心肌细胞凋亡 将石蜡切片用二甲苯漂洗2次，然后用梯度乙醇漂洗。PBS冲洗后，加入蛋白酶K溶液，15 min后用双蒸馏水洗4次，放入封闭液中封闭；PBS冲洗，加入TUNEL反应液，避光下37℃孵育60 min；PBS冲洗，加入转化剂过氧化物酶(POD)，37℃孵育30 min；PBS冲洗，加入二氨基联苯胺(DAB)工作液；PBS冲洗，中性树胶封片，光镜下观察。

1.7Western印迹法检测心肌组织Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达 提取5组大鼠新鲜左心室心肌组织的蛋白，采用BCA法定量。电泳后用湿转法将蛋白质转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用洗膜缓冲液(TBST)配制的5%胎牛血清(BSA)室温封闭2 h后Bcl-2、Caspase-3及β-actin一抗(稀释度均为1∶1 000)37℃孵育1 h后4℃孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次10 min；用辣根过氧化物(HRP)标记的二抗(稀释度1∶8 000)37℃孵育1 h；经洗涤、显影、灰度扫描后，以β-actin为内参，目的条带与内参条带的灰度比值代表蛋白表达水平。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1心脏组织Masson染色分析 糖尿病大鼠心脏组织中心肌胶原纤维的沉积较Control组明显增加，而c1组、c2组使用H2S干预的糖尿病大鼠心肌组织中心胶原纤维的沉积面积比模型组大鼠明显减少。H2S组和Control组之间无明显差异。见图1。

2.2各组心肌Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原纤维比较 与Control组比较，模型组心肌中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维沉积面积明显上升，并且胶原纤维排列紊乱，而c1组和c2组心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维沉积面积较模型组有下降趋势，且排列较模型组心肌组织规则，H2S组与Control组无明显差异，见图2，表1。

2.3各组心肌TUNEL染色结果 与Control组相比，糖尿病大鼠心肌中凋亡细胞的数量明显增加，c1组和c2组心脏中凋亡细胞的数量较模型组明显减少，H2S组与Control组无明显差异。见图3。

图1 各组心肌组织形态学(Masson染色，×200)

图2 各组心肌中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的免疫组化检测(DAB，×100)

表1 各组心肌中Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达、心肌组织中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较

与Control组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.4各组心肌组织中Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平比较 与Control组比较，模型组心肌组织中Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.01)，心肌组织中Caspase-3蛋白表达明显上调(P<0.01)，而H2S组Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，c1组和c2组心肌组织中Bcl-2蛋白表达水平明显上调(P<0.01)；c1组和c2组心肌组织中Caspase-3蛋白表达水平明显下降(P<0.05，P<0.01)。见表1，图4。

图3 各组心肌细胞TUNEL染色结果(×400)

1～5：Control组、模型组、c1组、c2组、H2S组图4 各组心肌组织中Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达

3 讨 论

DCM病理结构改变主要表现为心肌细胞肥大、凋亡、坏死、心肌间质纤维化和微血管病变等〔6，7〕。心肌纤维化在DCM的发展过程中扮演着极其重要的角色，本研究显示糖尿病大鼠出现了心肌间质纤维化。

随着对糖尿病心肌纤维化机制研究的不断深入，发现细胞凋亡在其中起着关键作用〔8〕。研究表明，在DCM中，各种因素可导致心肌细胞内环境的紊乱，随着疾病的进展，细胞凋亡的程度增加逐渐超过了细胞增殖的速度，引起心肌凋亡范围扩大，凋亡的心肌细胞不能再生，逐渐被胶原纤维等替代，形成心肌纤维化〔9,10〕。当机体长期处于高糖、氧化应激、缺血等促凋亡因素作用下，将导致细胞线粒体外膜电位的改变及通透性的增加，从而引起凋亡因子从线粒体内释放至胞质，引发Caspases级联通路逐一被激活，引起Caspase-3、Caspase-9等细胞凋亡因子的产生，诱导凋亡的发生。Caspase-3的激活是细胞凋亡信号通路中的关键环节，它作为细胞凋亡的效应子能被上游的始动子激活，被激活的Caspase-3作用于下游特定的信号分子，使细胞产生一系列的生物形态学改变，最终可诱导细胞凋亡〔11,12〕。Bcl-2是第一个被证实可以降低细胞凋亡的蛋白，它通过调节线粒体膜上通透性转换孔的启闭维持细胞膜的通透性，干扰细胞色素C 的释放而阻断上游Caspase蛋白酶的激活，从而抑制细胞凋亡〔13〕。本研究提示长期的高糖刺激可以诱导心肌细胞凋亡的发生，糖尿病大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Caspase-3的表达明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下降，提示Caspase-3和Bcl-2在糖尿病心肌纤维化的发生发展过程中可能起着重要作用。

H2S存在于哺乳动物组织和细胞中，是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后的第三种具有广泛生理功能的新型内源性气体信号分子，已被证实在体内具有广泛的生物学效应，其在心血管系统具有抗细胞凋亡、抗氧化应激、抗炎症反应、抗纤维化等多种生物学效应。本研究结果提示H2S通过抑制Caspase-3上调和促进Bcl-2表达从而减轻细胞凋亡并改善糖尿病大鼠心肌纤维化。