朱涛,赵前进,王春花
1. 安徽理工大学医学院,淮南 232001 2. 安徽理工大学数学与大数据学院,淮南 232001 3. 莆田学院环境与生物工程学院,莆田 351100
有机磷农药在我国的农业生产中占农药使用量的60%~70%,常使用二元混配来提高药效[1],混合农药可通过不同的组合方式构成,各组分浓度或浓度配比发生变化时,农药混合物可能会发生更为微妙和复杂的相互作用[2],产生不同的毒性效应,如有机磷农药混合后多数表现为相加或协同作用[3-4],但也在其他浓度组合下存在拮抗作用,如敌敌畏与乙酰甲胺磷、毒死蜱、辛硫磷、乐果等[5-8]。因此,对于混合物毒性效应的评价与预测的模型,在生态毒理学中,目前常用的加和参考模型有浓度加和模型(concentration addition, CA)和独立作用模型(independent addition, IA),通常认为CA模型适用于评估具有相似作用模式化学物的混合物,而IA模型则适用于具有相异作用模式化学物的混合物[9]。由于大多数混合物的作用机理尚不明确,作用模式的相似度问题并未有严格、统一的判断标准,使得选用CA或IA难以确定,CA虽然常被认为是混合物预测的标准模型,却缺乏坚实的理论支持[10]。在加和模型中,等效图法是一种评价二元混合物相互作用的经典分析方法,它是具有相同效应(通常是半数效应)的浓度点组合,构成的二维浓度图,可描述混合物中两组分之间的毒性相互作用,但若要获得较为完成的等效线图,须按固定浓度比来设计具有多种浓度比的大量二元混合物毒性测试[11]。近年来,该方法被一些学者重视并有相应的研究成果,如利用等效线图法,吴宗凡等[12]对重金属与有机磷农药二元混合物对卤虫联合毒性的评价及预测;王成林等[13]对离子液体与甲霜灵二元混合物的联合毒性的研究;Zhang等[14]对4种二元混合物的9种混合效应的研究等;另外,Salat等[15]用一种新等效线图法研究镇痛药相互作用;Luszczki等[16-17]拓展了三维等效线图法的研究等。因此,本文在前期基于FH插值法理论[18]构建二元有机磷混合物联合作用新模型的基础上,为进一步探索新模型在评价二元混合农药中的应用,选择野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)为受试生物,利用敌敌畏(dichlorvos, DDVP)和久效磷(monocrotophos, MCP)2种有机磷农药混合物进行联合毒性试验,将三维联合作用曲面与二维等效线图结合,构建三维等效线图,以期将二元混合农药之间的相互作用实现可视化表征,并快速、全面、有效地判断联合毒性作用。
野生型秀丽隐杆线虫N2株由国际线虫遗传中心提供,安徽理工大学地球与环境学院环境与健康实验室进行同步化培养[19]。敌敌畏(分子式C4H7Cl2O4P,CAS号62-73-7,纯度98%)与久效磷(分子式C7H14NO5P,CAS号6923-22-4,纯度99%)均为美国Sigma公司产品。
急性毒性试验:分别将DDVP、MCP溶解于含E.coliOP50的Km溶液(53 mmol·L-1NaCl,32 mmol·L-1KCl);DDVP暴露浓度选择15 μmol·L-1、30 μmol·L-1、45 μmol·L-1、60 μmol·L-1、75 μmol·L-1、100 μmol·L-1;乐果暴露浓度为5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1、20 mmol·L-1、25 mmol·L-1、30 mmol·L-1、35 mmol·L-1。20 ℃下置于24孔板中培养线虫,10条/孔同步化的L4期(56 h±0.5 h)线虫,设4个平行孔/组,将线虫放入不同浓度染毒液作用4 h后,显微镜下观察,用铂金丝针轻触线虫后无任何反应,则视为个体死亡,记录死亡线虫数目,实验重复3次,线虫死亡率取平均值。 联合毒性试验:DDVP浓度设置为10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1;MCP浓度设置为5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1,以3×3矩形数据要求配制混合染毒浓度进行联合毒性试验。实验方法同急性毒性试验,实验重复3次,线虫死亡率取平均值,同时设置空白对照组[20]。
利用FH插值分析法计算二元有机磷农药混合物联合作用表达式,方法参见文献[8];利用SPSS16.0分析软件中概率单元法,计算单一农药急性染毒作用24 h下,分别致秀丽隐杆线虫30%、50%、70%致死率对应的农药浓度(以下分别简称LC30、LC50、LC70)及95%置信区间(CI)[21-22];使用R软件对联合毒性结果进行交互性分析;基于Matlab13.0绘制联合效应曲面和不同致死效应的等效线等图形。
等效线图法(Isobologram)于1953年由Loewe提出[23],1981年Berebaum给出了多种生物活性物质混合物的等效线图[24],分析了混合物毒性相互作用,进而进行判别混合物是否产生协同、加和或拮抗作用。分析步骤如下:(1)分别求出2种化合物单一作用下的LC50及CI,再分别以横、纵坐标代表2种化合物的剂量并取各自LC50点相连为直线,若该混合物中2种化合物无相互作用,这条直线即为50%效应的浓度加和等效线(简称加和等效线),2种化合物的CI值的上、下限分别连接,围成50%效应的加和等效线置信区间;(2)依据预测混合物致线虫50%死亡效应的浓度中2种化合物各自实际的剂量,对应的坐标点即混合物50%效应的观测等效点;(3)根据观测等效实验点与加和等效线置信区间的位置关系,对联合作用进行评价。观测点落在加和等效线置信区间,则为相加作用;落在下方,则为协同作用;落在上方,则为拮抗作用[25]。同理,加和等效线还可以取30%效应、70%效应等任意效应进行判断。
图1 DDVP、MCP单一作用秀丽隐杆线虫的剂量-效应曲线Fig. 1 The dose-effect curves of dichlorvos (DDVP) and monocrotophos (MCP) solely on C. elegans
LC30LC50LC70DDVP concentration/(μmol·L-1)35.40(CI: 26.85~41.64)43.55(CI: 36.00~50.76)53.58(CI: 45.99~64.95)MCP concentration/(mmol·L-1)13.15(CI: 9.12~16.07)16.96(CI: 13.35~20.55)21.87(CI: 18.11~28.36)
图2 DDVP与MCP联合作用的效应曲面与等效线图Fig. 2 The isobologram and the surface of combined effects of DDVP and MCP
利用SPSS16.0 计算DDVP及MCP单一作用下,对秀丽隐杆线虫LC30、LC50、LC70及CI,结果见表1,可见同一致死率下,DDVP浓度远低于MCP浓度,故DDVP毒性大于MCP。另外,通过Origin8.0绘制DDVP及MCP单一作用时的剂量-效应曲线图,如图2所示,可见单一作用下,线虫死亡率与MCP、DDVP呈剂量依赖关系。
不同浓度配比下DDVP与MCP混合物联合作用秀丽隐杆线虫4 h的死亡率,如表2所示。当DDVP浓度固定时,线虫死亡率随MCP浓度的增加而增加,但DDVP浓度为50 μmol·L-1时,线虫死亡率达到100%,与MCP浓度增加无关;当MCP浓度固定时,线虫死亡率随DDVP浓度的增加而增加,可见线虫死亡率与DDVP、MCP剂量呈依赖性关系。
FH插值分析法求得DDVP和MCP二元混合物联合作用表达式R(x,y):
R(x,y)=0.574×10-3/[(x-10)×(y-5)]-0.1305666667×10-2/[(x-10)×(y-10)]+17/{[18000×(x-10)]×(y-20)}-0.1570488889×10-2/[(x-25)×(y-5)]+0.2844266667×10-2/[(x-25)×(y-10)]-1/{[(625×(x-25)]×(y-20)}+1/{[750×(x-50)]×(y-5)}-1/{[500×(x-50)]×(y-10)}+1/{[1500×(x-50)]×(y-20)}/1/{[45000×(x-10)]×(y-5)}-1/{[30000×(x-10)]×(y-10)}+1/{[90000×(x-10)]×(y-20)}-1/{[28125×(x-25)]×(y-5)}+1/{[18750×(x-25)]×(y-10)}-1/{[56250×(x-25)]×(y-20)}+1/{[75000×(x-50)]×(y-5)}-1/{[50000×(x-50)]×(y-10)}+1/{[150000×(x-50)]×(y-20)}。
表2 敌敌畏(DDVP)与久效磷(MCP)联合作用秀丽隐杆线虫的死亡率Table 2 Mortality rate of C. elegans induced by mixture of dichlorvos (DDVP) and monocrotophos (MCP)
利用R绘制该混合农药联合作用曲面图,如图2所示,其中x轴、y轴、z轴分别代表DDVP浓度、MCP浓度和线虫致死率。该曲面模拟混合农药整体联合作用效果,可以内推实验设计浓度范围内,DDVP与MCP混合物任一浓度组合下对应的线虫死亡率。
在图1中,选取等高线z= 50%,将等高线与联合作用效应曲面的交线向下投影,取得混合农药致50%线虫死亡时,混合物中DDVP和MCP所有不同浓度组分下联合作用的观测等效线(简称LC50观测等效线),如图2-b中红色线段所示。依据等效线图法,在x轴、y轴上分别标出DDVP、MCP单一作用下LC50及CI,并将各自LC50值、CI上限值、下限值对应连线,划出50%线虫致死效应时加和等效线及置信区间。依据等效线图法评价联合毒性的原理,从图2-b可见,混合物LC50观测等效线在加和等效线置信区间内,因此,判断两农药联合作用为相加作用。同理,还可作出选取30%、70%线虫致死效应下混合农药的观测等效线(分别简称为LC30、LC70观测等效线),分别如图2-a、2-c中红色线段所示,可见LC30、LC70观测等效线均在对应效应下的加和等效线置信区间内,故判断混合物此时致死效应下,两农药的联合作用也为相加作用。
使用Bartlett检验方法,分别对DDVP和MCP两因素进行方差齐性检验,检验结果显示:DDVP和MCP两因素方差分析结果均表明处理组数据满足方差齐性的要求,其中对DDVP方差齐性检验P> 0.05(P= 0.1209),对MCP方差齐性检验P> 0.05(P= 0.2017)。方差齐性检验后,对DDVP和MCP混合后的致死率进行交互作用的方差分析,如图3所示,可见各曲线无明显的相交情况出现,因此认定DDVP和MCP没有交互作用,表明两农药混合后的联合毒性表现为相加作用。
图3 DDVP和MCP整体交互效应图Fig. 3 Diagram of the overall interaction effects of DDVP and MCP
Rajini等[26]观察到DDVP、MCP对秀丽隐杆线虫的4 h-LC50分别为39 μmol·L-1和16.23 mmol·L-1;Cole等[27]在15种有机磷农药对秀丽隐杆线虫的行为毒性研究中,依据行为半数有效浓度结果,发现DDVP毒性大于MCP毒性,上述研究结果与本试验结果基本一致。
等效线图法是研究2种化学物质相互作用的经典方法,同时也是充分得到数学证明的一种评价化学物质相互作用的方法,在毒理学及药理学都得到广泛的应用。研究者通常采用等毒配比某一浓度下联合作用的交点与CA加和线(一般选择50%效应)的位置关系判断2种化学物质的联合作用。在实验设计中,本研究依据单一农药的急性毒理学实验结果,由低浓度到高浓度各选择3组,构建3×3矩形数据以满足基于FH插值法构建联合作用模型的条件,建立的模型可预测混合物中各组分不同浓度组合达到的效应,从而摆脱等效线图法中须按照指定条件进行浓度配比要求的约束。本研究利用的新联合作用模型及等高线获得二元有机磷农药混合物联合作用观测等效线,参照等效应线图法判断联合作用原理,在二维坐标图中确定浓度加和线及置信区间,依据混合农药观测等效线与加和等效线置信区间的位置关系进行判断,将混合农药是否存在拮抗、协同或相加的联合作用实现可视化表征,清晰、直观地显示了联合作用效果。
当前,随着试验方法学的不断发展,混合物某一效应水平上的毒性数据,如50%效应水平,已不是评估混合毒性的唯一指标,多个效应水平下的评估,方可提高整体联合毒性评价的准确性。所以,本研究利用求得的混合物联合作用观测等效线,实现了对任一联合作用效果评价的预测分析,如选择LC30、LC50和LC70观测等效线,从低效应水平到高效应水平来全面评价DDVP和MCP混合物联合毒性效应,丰富了等效线图法的内容及其应用范围,达到全面评价二元有机磷混合物联合毒性效应的要求。同时,通过多元统计对整体样本数据的交互作用分析,证实DDVP和MCP混合物整体联合作用为相加作用,与等效线图法分析结果一致,进一步验证了新模型推导的联合毒性观测等效线可正确判断二元有机磷混合物的联合作用效果,表明新模型适用于传统联合评价方法。
因此,利用FH插值法构建的二元混合物联合作用效应曲面,可求得混合物任一效应下观测等效线,不仅可以直观、简洁地全面评价二元混合农药联合毒性效应,而且可预测任一效应下的混合物中各组分浓度的全部组合,切实提高了分析效率[28],为帮助选择适当的混合比例提供参考依据和新的解决方法。另外,对于本方法在其他农药的二元混合物毒性评价的适用性,笔者也将继续开展相关实验进行深入讨论研究。