新型循环提取方法研究miRNA-21在NSCLC中的预测价值

荣 昊，任伟宏，李延卿，何 鑫，冯 倩，李文博，冯慧洁

(1.河南中医药大学，郑州 450000；2，河南中医药大学第一附属医院检验科，郑州 450000)

肺癌是全世界范围内癌症的首要死因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌病死率的85%[1]。在NSCLC发病早期做出正确诊断的患者5年生存率明显较高，但大多数肺癌都是因为出现明显症状才被发现，而此时疾病已经发展到中晚期，有大约10%的NSCLC患者在初诊时即已出现脑转移，且平均生存期仅有4个月[2]。与应用乳腺X线检测乳腺癌或者应用结肠镜检测结肠癌不同，除了病理活检并没有可靠的手段用于NSCLC的早期诊断。因此，越来越多的研究专注于寻找NSCLC的早期生物标志物[3-4]。

外泌体是一种极其微小的纳米级囊泡结构，其直径范围在30～100 nm[5-6]。研究证实，任何细胞均可以以胞吐的形式释放出外泌体，但肿瘤细胞的外泌体释放量远超正常细胞，并且可以稳定存在于各种体液中，如血液、汗液、尿液、精液、胸腔积液和腹水。在外泌体最开始被发现时一度被认为是“垃圾袋”，当时人们认为细胞通过外泌体这种“垃圾袋”将其自身不需要的废料排出体外[7]。然而近几年来人们通过对外泌体的不断探索，逐渐认识到它的巨大价值，尤其是对于肿瘤研究方面，外泌体可以对肿瘤微环境进行免疫调节，并通过促进肿瘤的转移前生态位形成加速肿瘤生长，甚至可以介导肿瘤细胞产生抗肿瘤药物抵抗[8-10]。此外，外泌体还特异性地包含mRNA、miRNA、dsDNA和蛋白质，可以作为不同肿瘤的诊断、预测和预后的生物标志物。更重要的是，外泌体可以被理解为细胞间的信息传递介质，它的内容物与肿瘤母细胞具有高度一致性，为肿瘤细胞特征的分析提供了一条新的途径。

在外泌体的众多内容物中，miRNA是被研究最多的分子，miRNA是微小的非编码RNA，它通过结合其靶mRNA的3′UTR来调节基因，导致靶基因表达的改变，通过这种方式，单个miRNA就可以同时对多个基因进行调节。miRNA在外泌体的保护下稳定地存在于血液中并不受RNase的降解，因此可以广泛地应用于癌症研究。在外泌体包含的众多miRNA中，miRNA-21在NSCLC患者外泌体中的异常表达被广泛研究。相关文献指出，在NSCLC中，表达水平较健康人明显上调的miRNA有miRNA-21、miRNA-205和miRNA-155，尤其以miRNA-21上调最为明显[11-14]。因为血液中的外泌体miRNA水平与它们在组织中的水平呈正相关，所以研究血清外泌体miRNA-21的表达水平对于了解NSCLC肿瘤组织中miRNA-21的表达水平，以及进一步研究肿瘤机制至关重要[14-15]。因此，本研究选取血清外泌体miRNA-21为目标RNA，研究其对于预测NSCLC患病风险的价值，及其与NSCLC病理、临床特征的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 血清标本收集于河南中医药大学第一附属医院，标本采集过程经过医院伦理委员会审核批准通过，所有患者均签署知情同意书。试验组为NSCLC患者血清30例，对照组为体检健康者血清10例。血清4 ℃冷藏保存。

1.2仪器与试剂 外泌体提取试剂盒PureExo®Exosome Isolation Kit(P101)购自美国101Bio公司；外泌体RNA提取试剂盒SeraMir Exosome RNA Amplification(140710-002)购自美国SBI公司；血清RNA提取试剂盒miRcute miRNA Isolation Kit(DP501)、逆转录试剂盒miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Syntesis Kit(KR211-02)、实时荧光定量PCR扩增试剂盒miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)(FP411-02)、miRNA检测外参(CR100-1)、miRNA外参检测引物(CD200-01)、miRNA-21检测引物(CD201-0092)均购自天根生化科技有限公司。ABI7500实时荧光定量PCR分析仪为美国应用生物系统公司产品；超净工作台、低温高速离心机为美国Thermo Fisher科技公司产品；透射电镜JEM-1400为日本电子株式会社(JEOL)产品。

1.3方法

1.3.1分离血清外泌体 取每例受试者血清标本400 μL，共计40例，设为A组，按照外泌体提取试剂盒PureExo®Exosome Isolation Kit(P101)说明书提取血清外泌体；将分离出的外泌体悬于PBS溶液中，置于4 ℃冰箱以备下一步操作。

1.3.2透射电子显微镜下验证外泌体形态 吸取30 μL分离纯化后的外泌体悬液加于载样铜网上，待网孔吸收后干燥10 min；加入20 μL洗液进行洗涤；重复洗涤后加入10 μL的电镜溶液，作用10 min；洗涤2次，在室温下干燥过夜；电镜下成像。

1.3.3提取外泌体RNA 按照外泌体RNA提取试剂盒seraMir Exosome RNA Amplification说明书要求提取血清外泌体中RNA；每例血清外泌体应当获得30～40 μL外泌体RNA；提取的外泌体RNA -70 ℃保存。

1.3.4提取血清RNA 再取每例受试者血清标本400 μL，共计40例，设为B组，按照血清RNA提取试剂盒miRcute miRNA Isolation Kit说明书要求提取血清RNA；提取的血清RNA不应少于15 μL，-70 ℃保存备用。

1.3.5miRNA-21表达水平检测 使用逆转录试剂盒miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Syntesis Kit对A、B两组RNA进行逆转录反应，获得cDNA，条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。再使用荧光PCR扩增试剂盒miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)进行扩增反应，PCR反应条件：95 ℃15 min预变性；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，此步骤进行5个循环，目的是富集低丰度目标miRNA；94 ℃ 20 s变性，60 ℃退火延伸，此步骤进行45个循环，每个循环末尾收集荧光。基因水平采用是2-ΔΔCt法计算，Ct值为标本曲线与阈值线交叉点的横坐标，ΔΔCt=(试验组CtmiRNA-21-试验组Ct外参)-(对照组CtmiRNA-21-对照组Ct外参)，此处的对照组规定为miRNA-21表达最低的一组。

2 结 果

2.1透射电子显微镜观察分离出的血清外泌体 透射电子显微镜下观察结果如图1所示，通过外泌体提取试剂盒PureExo®Exosome Isolation Kit(P101)分离得到的外泌体径粒大小均约为40 nm，呈囊泡状。

2.2A组与B组miRNA-21的表达水平比较 A组中，miRNA-21在NSCLC患者和体检健康者血清中表达差异无统计学意义(P>0.05)。而在B组中，NSCLC患者血清外泌体中miRNA-21的表达水平较体检健康者明显上调，上调倍数为2.93倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3血清外泌体miRNA-21预测NSCLC风险的ROC曲线 对B组miRNA-21表达水平进一步行ROC曲线分析，结果表明血清外泌体miRNA-21预测NSCLC风险价值高，曲线下面积为86.7%(P<0.05)，95%CI为0.721～1.000。当miRNA-21表达水平为54.71时，可得出最佳灵敏度(86.7%)和特异度(90.0%)，见图2。

表1 A、B两组中体健康者与NSCLC患者miRNA-21表达水平

图2 血清外泌体miRNA-21预测NSCLC风险的ROC曲线

2.4NSCLC患者血清外泌体miRNA-21表达水平与病理、临床特征的关系 NSCLC患者血清外泌体miRNA-21表达水平与病理分期、TNM分期有相关性(P<0.05)，与病理分型无关(P>0.05)，见表2。

表2 NSCLC患者血清外泌体miRNA-21表达水平与病理分型、病理分期、TNM分期的关系

3 讨 论

人体内的循环miRNA之所以可以在外周血中稳定存在，是因为被微泡、外泌体等囊泡包裹，或者与蛋白质结合形成复合物，免于受到血液中核糖核酸酶的降解，以及血液温度、酸碱度等不利因素的干扰[16-18]。常规的提取循环miRNA的方法是首先裂解包裹miRNA的膜结构，再提取释放入血清的游离miRNA，但miRNA性质极其不稳定，一旦释放入血液必定受到各种干扰因素的降解，影响提取效率，因此，有报道指出全血miRNA可能并不适用于筛选NSCLC[19]。针对以上问题，本项研究提出首先从血清中分离出外泌体，这就使得miRNA在被提取之前就已经随外泌体脱离血清，故可大大提高提取效率。

从另一个角度来讲，虽然所有细胞都可以分泌外泌体，但肿瘤细胞的外泌体释放量远超正常细胞，因此，癌症患者血清外泌体绝大部分来自于肿瘤细胞，在组成成分(包括蛋白质、DNA、mRNA、miRNA等)上与肿瘤母细胞保持高度一致性[20]。提取血清外泌体来代替肿瘤组织进行相关癌症研究，正是时下的三大液体活检技术之一。

本研究发现，血清外泌体miRNA-21高水平表达是NSCLC患病的高危预测因素，这与NSCLC肿瘤组织或肿瘤细胞中的结果一致，而如果直接从血清中检测miRNA-21的表达水平，体检健康者和NSCLC患者没有差异[14-15]。本研究还发现，NSCLC患者血清外泌体miRNA-21表达水平与病理分期、TNM分期相关，miRNA-21表达水平随着肿瘤细胞恶性程度的增高以及癌症病情的发展而升高。笔者推测，其机制可能是miRNA-21抑制细胞的分化并诱导细胞向肿瘤细胞转化，最终导致癌症的发生，并且在癌症进程中，miRNA-21进一步促进肿瘤细胞的浸润和转移。但是，NSCLC患者血清外泌体miRNA-21表达水平与病理分型不相关，这就提示在肺腺癌、鳞癌、大细胞癌肿瘤组织中miRNA-21表达水平无差异。

本研究存在一些不足之处，选取样本量较少，还需在接下来的研究中扩大样本量以进一步验证本文结果；本研究仅选取了NSCLC这一个癌症病种，没有涉及其他癌症类型的研究，故血清外泌体miRNA-21表达量升高在预测NSCLC风险中的特异性有待考证；对于miRNA-21在NSCLC疾病发展中的作用机制仅仅作出了推测，同样需要进一步研究验证。

外泌体是一个相对较新的研究领域，许多研究团队已经对这个领域产生了兴趣，并且发表了许多颇有见解的文章，然而至今为止却尚未建立一个成熟的分离和分析方案，对于如何很好地应用外泌体也缺乏共识。这些事实表明，在了解外泌体的功能作用方面还有很长的路要走，我们需要进一步研究外泌体的内容物如miRNA如何作用于肿瘤细胞，以及如何在癌症的诊断和预后中发挥作用，并通过对外泌体miRNA的研究来帮助我们理解癌症的机制，最终指导临床靶向用药。