HBsAg与尿液中HBV-DNA的相关性及联合检测对HBV-GN患者诊断效果的研究

郭燕妳，许海涛，吴西丽

(广东省深圳市光明新区人民医院检验科 518106)

乙型肝炎病毒(HBV)感染率非常高，据报道目前全球有感染者近20亿，其中慢性乙型肝炎约3.5亿，我国HBV人群携带率达15%以上，现有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性者约9 300万，每年新发感染者10万例[1]。HBV感染会导致肝脏病变及多种肝外病变，严重危害患者健康。HBV相关性肾炎(HBV-GN)是最常见的肝外病变之一[2-3]。尽管膜性肾病是HBV-GN最常见的病理分型，其进展缓慢，但有研究称近30.0%的患者最终会进展为末期肾病[4]。因此，能够早期明确诊断HBV-GN对患者意义重大，能够为临床医生优化治疗方案提供参考并降低终末期肾病的发生率。传统的诊断标准是通过肾穿刺进行组织活检，尽管肾穿刺能够直观地发现肾小球变化，但是肾穿刺存在许多弊端[5]。因此，临床上迫切需要一种新的HBV-GN诊断方法及指标。本文研究了HBsAg定量检测与尿液中HBV-DNA的相关性，并分析了二者联合检验对HBV-GN的诊断效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2016年6月至2017年12月就治于本院肾内科及感染科的肾炎患者110例，其中男72例，女38例，年龄26～57岁，平均年龄(41.7±4.5)岁。分为HBV-GN组60例，非HBV相关肾性炎(Non-HBV-GN)组50例。HBV-GN的诊断标准[6-7]：(1)血清HBV抗原阳性；(2)排除狼疮性肾炎、过敏性紫癜及糖尿病等疾病引发的肾小球肾炎；(3)肾切片上找到HBV抗原，本项为基本条件，若为阴性不能诊断HBV-GN。排除标准：(1)存在穿刺的相对或者绝对禁忌证者；(2)病案缺失者。所有病例患者或其直系亲属签署知情同意书，并通过医院伦理委员会审批。两组患者的年龄、性别、病程及临床表现等基本资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

1.2方法

1.2.1病理诊断 两组患者均在B超定位下行经皮肾穿刺，由两名本院病理科副主任医师协商做出病理诊断，若存在争议，则由1名病理科主任医师做出最终诊断。标本处理：用生理盐水浸湿小块纱布，至手刚好拧不出水来为佳，标本放入纱布后，一并放入空小瓶中，放入冰盒中送检[8]。

1.2.2乙型肝炎标志物检测 采用发光法测定患者HBsAg及HBeAg，发光试剂盒购自强生生物技术有限公司[9-10]。所用仪器亦为强生Vitros 5600生化仪。

表1 两组患者的一般资料

1.2.3尿液HBV-DNA检测 收集患者中段晨尿15 mL，3 000 r/min离心10 min，采用购自广州中山大学达安基因股份有限公司的DNA提取试剂盒提取患者尿液中的HBV-DNA，用PCR技术定量检测患者尿液中的HBV-DNA，采用美国ABI7500 PCR仪进行检测。PCR反应条件：93 ℃下2 min，93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s→10个循环，93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s→30个循环。阳性界定：尿液HBV-DNA载量≥100 copy/mL[11]。

1.2.4受试者工作特征曲线(ROC曲线) ROC曲线又称为感受性曲线，以灵敏度为纵坐标，(1-特异度)为横坐标。ROC曲线越靠近左上角,该诊断方法的准确性就越高，比较各种诊断方法的ROC曲线下的面积(AUC)，AUC最大的即为最优的诊断方法[12]。约登指数=灵敏度+特异度-1，是评价筛查试验真实性的方法，表示发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大[13]。

2 结 果

2.1两组患者肾炎病理分型的比较 HBV-GN组以膜性肾病为主(51.7%)；而Non-HBV-GN组以毛细血管内增生性肾炎为主(30.0%)，两组患者的肾炎病理分型差异有统计学意义(χ2=12.309，P<0.05)，见表2。

2.2两组患者的乙型肝炎标志物检测结果比较 HBV-GN组患者的血清HBsAg、血清HBeAg及尿液HBV-DNA的定量和定性检测均高于Non-HBV-GN组(均P<0.05)，其中血清HBsAg定量、尿液HBV-DNA的定量和定性差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.3HBV-GN组HBsAg定量与尿液HBV-DNA的相关性分析 HBeAg阳性患者的HBsAg定量及尿液HBV-DNA拷贝数均显著高于HBeAg阴性患者(P<0.05)；HBeAg阳性、阴性患者HBsAg定量与尿液HBV-DNA拷贝水平均有相关性(r=0.718、0.314，P<0.05)，见表4。

表2 两组患者肾炎的病理分型结果[n(%)]

表3 两组患者乙型肝炎标志物检测结果比较

注：-表示无数据

表4 HBV-GN组HBsAg定量与尿液HBV-DNA的相关性分析

2.4HBsAg定量、尿液HBV-DNA及二者联合检测诊断HBV-GN的ROC曲线分析 HBsAg定量与尿液HBV-DNA联合检测诊断的灵敏度和特异度最高的，其次是尿液HBV-DNA检验，最差的是HBsAg定量检测，见图1及表4。

图1 ROC曲线

2.5HBsAg定量、尿液HBV-DNA及二者联合检测对HBV-GN的诊断效能 HBsAg定量与尿液HBV-DNA检测相比，灵敏度及特异度差异均无统计学意义(P>0.05)；联合检测的灵敏度及特异度均优于HBsAg定量和尿液HBV-DNA单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 对HBV-GN的诊断效能分析

注：与联合检测相比，△P<0.05,□P<0.05

3 讨 论

HBV感染已经成为全球面临的严重公共卫生问题，据GANEM等[14]报道，全球约有20亿人感染过HBV，每年有近100万人死于感染HBV后导致的肝衰竭及肝硬化等相关疾病。然而HBV感染可累及患者多个器官，对肾脏等也会产生严重损害。早在20世纪70年代，COMBES等就发现HBV感染和肾小球疾病的关系[15]。膜性肾病是最常见的病理分型，本研究中膜性肾病占51.7%，与潘楚瑛等[16]研究报道的50.0%接近。HBV-GN患者可有血尿、水肿、高血压及低蛋白血症等肾炎表现或者是肾病综合征表现，但患者症状不典型，病情多变，肾炎表现与肾病表现可互相转变，无一定规律可循，再加上HBV-GN的发病机制目前仍不明确，使得HBV-GN的诊断变得复杂。

有研究表明，循环免疫复合物沉积或者肾组织与HBV相关抗体形成原位免疫复合物可能是HBV-GN的发病机制，而且有学者用South blot和PCR在肾脏组织中检测到了HBV环状DNA分子(HBV CCCDNA)[17]。HBV CCCDNA是HBV基因组进入机体细胞核后以长链为模版，短链延长之后形成的；以HBV CCCDNA为转录模版，再翻译出包括HBsAg在内的各种病毒蛋白。本研究中，HBV-GN组血清HBsAg、血清HBeAg及尿液HBV-DNA的定量和定性检测高于Non-HBV-GN组，其中以血清HBsAg定量、尿液HBV-DNA的定量和定性检测差异最为显著，结果提示乙型肝炎血清标志物对HBV-GN的诊断仍具有重要作用。考虑到血清HBV-DNA阳性能精确、直接地衡量HBV的复制，因此，本研究推测患者尿液HBV-DNA阳性及HBsAg检测对诊断HBV-GN及进一步了解该疾病的发病机制有一定价值。

本研究评估了HBeAg阳性患者的HBsAg定量与尿液HBV-DNA拷贝水平的相关性(r=0.718,P<0.05)，而HBeAg阴性患者的HBsAg定量与尿液HBV-DNA拷贝水平的相关性检测(r=0.314，P<0.05)，尽管相关性不如HBeAg阳性患者显著，但仍能提示HBsAg定量与尿液HBV-DNA拷贝水平具有很高的一致性。本研究结果与余雪平等[18]的研究结果相似，但也有学者报道HBsAg定量与尿液HBV-DNA拷贝水平无明显相关性[19]。原因可能是患者处于不同的HBV感染后的疾病分期，机体内HBsAg表达水平不尽相同，HBV-DNA复制能力存在差异；也有可能是分组标准和所用试剂的灵敏度不同所致。

ROC分析3种诊断方式的效能，结果显示HBsAg定量检测的灵敏度为0.58，特异度为0.59;尿液中HBV-DNA检验的灵敏度为0.64，特异度为0.63;联合检测灵敏度为0.79，特异度为0.78，联合检测显著优于单一检测，原因可能是HBV-DNA某些区段存在突变。本研究中仅检测了肾组织的HBsAg，而HBV感染人体后形成的循环免疫复合物包括了HBsAg、HBeAg及HBV核心抗原(HBcAg)的抗原抗体复合物，相对分子质量较低的HBeAg免疫复合物能经肾小球滤过并沉积在内皮下，使得HBsAg定量诊断HBV-GN的假阴性增高；也有可能是病理诊断标准是1989年我国学者制订的HBV-GN诊断标准，其中肾组织中检测到HBV抗原是基本条件，但是最近有研究称HBV沉积与病变并无直接关系，免疫复合物的沉积才是密切相关的，而HBV抗原沉积在肾小球后不一定引起异常免疫反应并产生大量免疫复合物沉积，因而参照此诊断标准会使阳性率升高[17]。因此，研究结果尽管提示联合检测诊断HBV-GN的灵敏度和特异度均未达到90.0%，但仍可以考虑将HBsAg定量联合尿液HBV-DNA检测作为HBV-GN的诊断的重要参考。而且笔者考虑为了有效降低诊断的假阴性及假阳性，可在后续的研究中分析尿液HBV-DNA、HBsAg定量、HBeAg定量等多个指标的相关性并探索其联合检测的诊断效能。

综上所述，HBsAg定量与尿液HBV-DNA拷贝水平有很好的一致性，二者的检验信息可以互补，HBsAg定量与尿液HBV-DNA联合检测的结果可作为HBV-GN诊断的重要参考。