文拉法辛对抑郁模型大鼠认知功能及海马神经元凋亡的作用研究

杨 茜 王 静 裴双义

(唐山市工人医院导管室,唐山063000)

抑郁症是一种心身疾病,以焦虑、睡眠障碍、食欲变化和缺乏快感为特征,发病率高，治疗效果差，严重危害人类健康。抑郁症发病原因复杂，海马神经元细胞的凋亡或坏死、神经细胞突触的可塑性受到损害是其可能机制[1]。海马是非常重要的脑区，在认知能力、学习记忆能力、情感、行为等诸多方面发挥不可替代的作用。多项研究表明，抑郁症能够导致患者海马体积变小，海马神经元数量变少、树突结构重建受阻、海马萎缩，而抗抑郁药物能够较好地缓解这一过程[2]。

磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/serine/threonine kinase,PI3K/AKT)P13K/Akt通路在细胞生长、糖代谢、增殖、核糖体功能、转录和凋亡等方面起着关键的作用。P13K是一种重要的蛋白激酶，P13K活化后，可进一步磷酸化激活Akt，并调控下游的雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、半胱天冬酶(Caspase)、B细胞淋巴瘤基因-2/及其相关X蛋白(B cell lymphoma-2/Bcl-2 Associated X protein,Bcl-2/BAX)等多条信号通路的活性，该信号通路被公认为具有很强的促进细胞生长和抗凋亡能力,影响细胞增殖、凋亡及其他生物学行为[3]。

Venlafaxine(文拉法辛)是一种新型的抗抑郁药，作用于5-羟色胺和去甲肾上腺素,有效地抑制再摄取,同时抑制多巴胺的再摄取,进而改善抑郁患者临床症状。本研究以抑郁模型大鼠为研究对象，观察文拉法辛对其行为学、认知功能、海马神经元的形态、结构和凋亡与凋亡蛋白的关系及对PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响，进一步研究文拉法辛抗抑郁的机理，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与材料 雄性SD大鼠100只，SPF级，体重180～200 g，北京维通利华公司采购，恒温23℃，昼夜节律光照，自由随意进食。 Venlafaxine(文拉法辛)购自惠氏制药有限公司。从美国罗氏公司购得TUNEL凋亡试剂盒。尼氏染色试剂盒购自北京雷根生物科技有限公司。PI3K、pAKt、BCL-2、BAX、mTOR、Caspase-3蛋白一抗购自英国Abcam公司。二抗购自中杉金桥有限公司。

1.1.2实验仪器 自制强迫游泳仪。旷场测验箱购自美国Med公司。-80℃冰箱购自美国SANYO公司。光学显微镜从日本索尼公司购买。Western blot系统是从美国Bio-Rad公司购买。Morris水迷宫设备，购自上海鑫软科技公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型建立 100只SD雄性大鼠，喂养7 d适应环境后，采取旷场实验评估，标准水平活动得分40～100分。将符合条件的大鼠随机分为5组,对照组，模型组和文拉法辛1、2、3组。对照组正常喂养，除行为学测验外无其他刺激。模型组及文拉法辛1、2、3组采用慢性无法预见性应激(CUMS)刺激联合孤养方式，喂养21 d，建立抑郁模型[4-6]。CUMS包括8种不同刺激，4℃冰水中游泳，停止供水24 h，停止供食24 h，连续夹尾 1 min，捆绑束缚2 min，悬挂5 min，昼夜逆转24 h，45℃水温游泳5 min。每天一种刺激，连续3 d，刺激不重复。造模完成后进行旷场实验及糖水消耗实验评估造模是否成功[4-6]。建模成功后，文拉法辛1、2、3组分别腹腔注射文拉法辛5、15、45 mg/(kg·d)，模型组注射盐水，连续14 d。

1.2.2行为学测定

1.2.2.1旷场实验 在刺激前、造模后及给药14 d后，采用ENV-520旷场测验仪跟踪大鼠的活动，对自发活动和探索能力进行检测,分析时间3 min,活动总路程记录。

1.2.2.2糖水消耗试验 实验前大鼠已行糖水适应训练。在应激刺激前、造模完成后及给药结束后均进行糖水消耗试验。停止供水12 h后，各组大鼠按只分别给予1瓶1%蔗糖溶液和1瓶纯水，在1 h的自由随意饮用后,蔗糖水和纯水进行称重，衡量糖水消耗和糖水偏好指数=蔗糖水消耗/总液体消耗×100%。

1.2.2.3强迫游泳实验 大鼠放置于大水桶中，高50 cm直径30 cm，水深30 cm， 25℃水温，预强迫游泳15 min，恢复24 h，强迫游泳5 min，记录各组大鼠静止不动状态的时间，即为浮在水面、停止挣扎或只存在肢体的微小活动确保头部浮起的时间。

1.2.3水迷宫实验 使用Morris水迷宫对大鼠认知功能进行评价。水迷宫为恒温圆柱形水池，池水及池壁颜色均为黑色，分4象限，2象限下面隐蔽平台距离水表面2 cm，固定位置。将大鼠随机放入4个象限，分别进入水中，每组大鼠2 min的到达时间进行了记录，这是逃避潜伏期。如果老鼠不能在2 min 找到隐藏平台,大鼠放置在平台15 s，记录为潜伏期120 s。在第6天,平台被移走，大鼠进入水中，从先前的4个象限进入水中。计时2 min，大鼠通过平台象限的时间记录为空间探索时间。

1.2.4尼氏染色 大鼠灌注固定取海马，进行低温冰冻切片，晾干后先用二甲苯进行脱脂，再放入逆行浓度梯度的酒精溶液中进行脱脂，在蒸馏水中浸泡2 min，室温15 min甲苯胺蓝溶液(浓度为1%)染色，然后在蒸馏水中浸泡2 min， 95%乙醇分色，放入依次增加的酒精溶液中进行脱水，用二甲苯溶液进行切片透明，中性树胶封片，显微镜下观察海马细胞形态变化。

1.2.5TUNEL染色 海马组织切片后先进行脱蜡，再采用乙醇进行脱水，使用蛋白酶K进行消化，PBS溶液洗涤2次，滴入TUNEL反应液及复合液，采用DAB染色，最后再经苏木素染色，封片后观察。随机选取海马CA3区的组织切片3张，随机抽取5个视野，染色呈现为棕褐色的细胞为凋亡阳性细胞，在每个视野范围内均检测到棕色阳性细胞，计算数目后除以细胞总数，平均值为细胞凋亡率。

1.2.6Western blot方法检测 大鼠给药完成后取材，分离海马组织，放置于冰上，对组织进行研磨，加入蛋白裂解液，4℃离心30 min，蛋白质定量试剂盒操作定量。取相同量的样品,进行12%凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉过夜，封闭阻断抗体，一抗稀释溶液为0.5%BSA溶液，和印迹膜在室温下孵育2 h，取出用TBST洗膜10 min重复3次，二抗稀释溶液为0.5%BSA溶液，印迹膜在室温下孵育2 h后洗涤液TBST 15 min 重复3次，加入ECL试剂，凝胶成像仪观测和统计分析。

2 结果

2.1文拉法辛对抑郁模型大鼠自发活动的影响 旷场实验测得对照组、模型组、文拉法辛1、2、3组大鼠刺激前自发活动总路程比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后抑郁模型组及文拉法辛1、2、3组自发活动量明显低于对照组(P<0.05),差异有统计学意义，抑郁模型成功建立。造模后抑郁模型组及文拉法辛1、2、3组活动总路程比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药14 d后对照组与模型组自发活动路程与给药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。文拉法辛1、2、3组给药14 d后自发活动较模型组及给药前显著增加，且随着浓度升高而增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2文拉法辛对抑郁模型大鼠糖水消耗试验的影响 正常对照组，抑郁模型组和文拉法辛1、2、3组

刺激前糖水消耗试验和糖水偏好指数三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模成功后，抑郁模型组及文拉法辛1、2、3组活动糖水消耗和糖水偏好指数均显著低于对照组(P<0.05),差异有统计学意义，考虑抑郁模型建模成功。造模后抑郁模型组及文拉法辛组糖水消耗量和糖水偏好指数差异无统计学意义(P>0.05)。给药14 d后，对照组和模型组糖水消耗量和糖水偏好指数与用药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药14 d后文拉法辛1、2、3组糖水消耗和糖水偏爱指数较给药前及模型组显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着浓度升高而增加。见表2。

2.3文拉法辛对抑郁模型大鼠强迫游泳不动时间影响 给药结束后正常对照组、抑郁模型组、文拉法辛组大鼠强迫游泳不动时间分别为(89.1±10.2)s、(138.7±16.6)s和(92.6±10.5)s。对照组强迫游泳不动时间最短，抑郁模型组强迫游泳不动时间长于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较文拉法辛组强迫游泳不动时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)，文拉法辛组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。见表3。

2.4文拉法辛对抑郁模型大鼠水迷宫实验结果比较 给药结束后正常对照组、抑郁模型组、文拉法辛1、2、3组逃避潜伏期分别为(8.7±2.8)s、(21.8±5.0)s、(11.9±2.6)s、(10.8±2.5)s和(10.4±2.7)s，空间探索时间分别为(9.7±3.4)s、(20.6±3.4)s、(12.4±3.9)s、(11.8±3.6)s和(11.4±2.9)s。

表1文拉法辛对抑郁模型大鼠自发活动的影响

Tab.1EffectofVenlafaxineonspontaneousactivityindepressionmodelrats

Note:Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05.

表2文拉法辛对抑郁模型大鼠糖水消耗试验的影响

Tab.2EffectsofVenlafaxineonsugarwaterconsumptiontestindepressionmodelrats

Note:Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05.

大鼠对照组逃避潜伏期和空间探索时间最短，模型组和文拉法辛1、2、3组逃避潜伏期和空间探索时间均长于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。文拉法辛1、2、3组逃避潜伏期和空间探索时间随着浓度升高而减少，均短于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.5文拉法辛对抑郁模型大鼠海马CA3区神经元形态的影响 正常对照组大鼠海马CA3神经元细胞层次丰富，排列整齐，包膜完整，形态正常，未见细胞坏死。抑郁模型组大鼠海马神经元层次变少，细胞萎缩、排列稀疏，胞核变小甚至固缩，坏死细胞多见。文拉法辛1、2、3组海马神经元细胞层次丰富，细胞形态规则，坏死细胞较少，较抑郁模型组大鼠海马神经元形态改善显著。见图1。

表3各组大鼠给药后强迫游泳及水迷宫实验结果比较

Tab.3Comparisonofexperimentalresultsofforcedswimmingandwatermazebyratsineachgroup

Groupsmotionless-time ofswimming by force(s)Escapelatency(s)Spaceexploration time(s)Control89.1±10.28.7±2.89.7±3.4Model138.7±16.61)21.8±5.01)20.6±3.41)Ven 192.6±10.51)2)11.9±2.61)2)12.4±3.91)2)Ven 292.2±11.61)2)10.8±2.51)2)11.8±3.61)2)Ven 391.9±10.71)2)10.4±2.71)2)11.4±2.91)2)

Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

图1 文拉法辛对抑郁模型大鼠海马CA3区尼氏染色(×200)的影响Fig.1 Effect of Venlafaxine on hippocampal CA3 region of depression model rat with Nissl straining(×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Venlafaxine group 1；D.Venlafaxine group 2；E.Venlafaxine group 3.

2.6文拉法辛对抑郁模型大鼠海马CA3区神经元凋亡的影响 TUNEL色中棕褐色即为凋亡阳性细胞。正常对照组凋亡细胞数量少见，凋亡率(8.9±1.1)%；抑郁模型组凋亡细胞显著增加(53.5±3.7)%，与正常对照组相比差异具有显著统计学意义(P<0.01)；文拉法辛1、2、3组凋亡率分别为(18.6±2.4)%、(16.3±1.7)%和(13.2±1.9)%，随着文拉法辛浓度增加而降低，与模型组比较，凋亡细胞出现明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、3。

图2 文拉法辛对抑郁模型大鼠海马CA3区TUNEL染色(×200)的影响Fig.2 Effect of Venlafaxine on hippocampal CA3 region of depression model rat with TUNEL straining(×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Venlafaxine group 1；D.Venlafaxine group 2；E.Venlafaxine group 3.

图3 文拉法辛对抑郁模型大鼠海马神经元TUNEL凋亡率的影响Fig.3 Effects of Venlafaxine on apoptosis rate of hippoca-mpal neurons of depression model ratsNote: Compared with the control group,**.P<0.01；compared with the model group,##.P<0.01.

图4 文拉法辛对抑郁模型大鼠各蛋白水平的影响Fig.4 Effects of Venlafaxine on levels of protein in depression model rats

2.7文拉法辛对抑郁模型大鼠海马PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白表达的影响 模型组、文拉法辛1、2、3组与正常组比较，PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，bax和Caspase-3的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。文拉法辛1、2、3与模型组比较，PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，bax和Caspase-3的表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。且文拉法辛1、2、3组各蛋白的表达均具有浓度依赖性。见图4。

3 讨论

在我们这项研究中，慢性无法预见性应激(CUMS)孤养21 d被用来建立大鼠抑郁模型，模型大鼠的自发活动较前降低(P<0.05)，大鼠出现反应迟钝、活动减少、不喜饮食、糖水偏好指数和糖水消耗量明显下降(P<0.05)，提示本研究抑郁模型大鼠造模成功，与其他文献报道一致[4-6]。文拉法辛能够抑制脑细胞中去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取，可以有效改善抑郁症状，是一种广泛使用的临床抗抑郁药[6-8]。给予文拉法辛处理抑郁模型大鼠后，与抑郁模型组比较，大鼠自发活动，糖水偏好指数及糖水消耗量显著增加，强迫游泳不动时间缩短，提示文拉法辛能够改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为，与其他研究报道结果一致[6,8-11]。

多项研究证实，抑郁患者常常伴有海马形态的萎缩和认知功能的受损[12,13]。水迷宫能够检测大鼠认知功能，本研究通过水迷宫实验，发现抑郁模型大鼠逃避潜伏期和空间探索时间较正常对照组明显延长，说明抑郁模型大鼠导致大鼠认知、学习记忆能力的损害。文拉法辛处理后，逃避潜伏期和空间探索时间较模型组明显缩短，说明文拉法辛能够改善抑郁模型大鼠的认知功能。

慢性抑郁患者头颅MRI提示患者大脑区域较正常人缩小，海马萎缩严重，神经元数量变少，尤其以海马齿状回和CA3区的神经元细胞损害最为严重[14-16]。慢性应激状态建立抑郁模型大鼠，能够引起大鼠海马功能结构的变化，导致海马神经元的凋亡，出现大脑功能的损害，海马CA3区是损伤的典型部位，其损伤程度与抑郁行为保持一致[16,17]。本研究发现，抑郁模型大鼠海马神经元萎缩及坏死较为严重，且海马神经元凋亡率较正常对照组显著增加，文拉法辛药物处理后海马神经元形态规则细胞完整，萎缩及坏死细胞较少，形态结构较模型组改善显著，且海马神经元凋亡率较模型组显著下降，提示文拉法辛能够减少海马神经元的凋亡率，对海马神经元细胞有保护作用。

PI3K/Akt信号通路中活化的P13K激活Akt，信号进一步转导，Akt激酶能调控下游的mTOR、Caspase、BAX/Bcl-2等多条信号通路的活性，引起级联反应，参与细胞的生理代谢过程[18]。BAX和BCL-2是常见的促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白， caspase-3是细胞凋亡级联的关键酶,是细胞凋亡级联的核心,Caspase-3酶的水解活性超细蛋白作用可直接诱导细胞凋亡，并能损伤DNA加速凋亡[3,18-20]。研究显示，抗抑郁药能够影响PI3K/Akt信号通路[3,17,18]。本研究显示，抑郁模型组与正常组比较，PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2表达明显下降，BAX、Caspase-3表达明显增加，文拉法辛处理后与抑郁模型组相比能够显著提高PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2的表达(P<0.05)，显著降低BAX、Caspase-3表达，提示文拉法辛能够通过PI3K/Akt信号通路抑制海马神经元细胞的凋亡。

综上所述，文拉法辛能够改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为和认知功能，并且能够通过PI3K/Akt信号通路改善抑郁模型大鼠的海马神经元凋亡。