清开灵注射液细菌内毒素检查法研究

云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000

清开灵注射液为八种中药组成的复方制剂，呈棕黄色或棕红色澄明液体，具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍的功能，临床用于热病、神昏、中风偏瘫、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染等，收载在2015年版《中国药典》一部。目前标准采用家兔法进行热原检查[1]，该检查方法所用家兔的饲养时间长，操作繁琐，实验结果受家兔的个体差异影响较大。而细菌内毒素检查法具有灵敏、快速、操作简便、结果准确等优点，为建立该品种细菌内毒素检查的可行性研究提供数据参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BET-48G细菌内毒素测定仪(天大天发科技有限公司)；ZH-2BLENDER涡式振荡器(天津药典标准仪器厂)。

1.2 试剂与药品 细菌内毒素工作标准品(CSE，批号：1607302，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂(TAL，批号1609021、1705041，标示灵敏度0.5 EU/mL，湛江安度斯生物科技有限公司；批号1607270、1708230，湛江博康海洋生物有限公司)；细菌内毒素检查用水(BET水，批号1607050，湛江博康海洋生物有限公司)；清开灵注射液(批号：170521B2、171031D1、171202A2，神威药业集团有限公司)。

2 方法和结果

2.1 鲎试剂灵敏度的复核试验 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，用BET水分别将CSE溶解并制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管，同时用BET水做2支阴性对照管。按2015年版《中国药典》(通则1143)[2-3]对TAL进行标示灵敏度复核，由表1可见，不同厂家鲎试剂灵敏度均符合规定。

2.2 内毒素限值(L)的计算 根据公式L=K/M，注射剂K=5 EU/kg·h。M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，根据说明书清开灵注射液最大剂量为40 mL，中国人均体重按60 kg计算，M=40 mL / 60 kg.1 h=0.667 mL/kg·h,则L=7.5 EU/mL。本品的限值设为每1 mL清开灵注射液中含内毒素应小于7.5 EU。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.3 干扰预实验最大有效稀释倍数(MVD)的确定 根据公式MVD=CL/λ，C为供试品溶液的浓度，L为供试品溶液的内毒素限值，MVD= CL/λ=1.0 mL/mL×7.5 EU/mL / 0.50(EU)=15。

2.4 干扰预试验 将供试品用BET水分别稀释，制成：原液、5、10、15倍作为供试品系列(NPC)，同时用上述每一个浓度的溶液制备成含1 EU/mL(2λ)浓度的内毒素溶液，将此系列溶液作为供试品阳性对照系列(PPC)。用λ为0.50 EU/mL的2个厂家的TAL分别与2个系列溶液反应，每一稀释度作2支。BET水作阴性对照(NC)，加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照(PC)，从表2可见清开灵注射液存在干扰作用，稀释15倍时，即不再对试验产生干扰。见表2、表3。

表2 清开灵注射液干扰预试验结果 (批号1609021，λ=0.5 EU/mL)

表3 清开灵注射液干扰预试验结果 (批号1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.5 干扰试验 根据干扰预实验结果，取3批清开灵注射液用BET水分别稀释15倍，用该稀释液稀释CSE，配制成细菌内毒素浓度为1.0、0.5、0.25、0.125 EU/mL的系列溶液及不含供试品的细菌内毒素溶液。每个浓度平行测定4管，分别与TAL反应，同时用供试品溶液和BET水作阴性对照(Tc)，进行干扰试验，当Tc为阴性时，结果按公式ES=lg-1(∑Xs/4)和Et=lg-1(∑Xt/4)计算，式中Xs和Xt分别为含和不含清开灵注射液系列各反应终点细菌内毒素浓度的对数值。ES均在0.5～2λ范围内，并且Et在0.5ES-2ES范围内，说明，15倍稀释后的清开灵注射液在此试验条件下，对TAL与细菌内毒素之间的凝聚反应无干扰作用，符合《中国药典》的判断标准。同时，可以确定清开灵注射液对TAL不产生干扰的浓度大于15倍，使用现市售标示灵敏度为0.5～0.03 EU/mL的TAL均可对清开灵注射液进行细菌内毒素检查。见表4、表5。

表4 清开灵注射液干扰试验结果 (批号1609021，λ=0.5 EU/mL)

表5 清开灵注射液干扰试验结果 (批号1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.6 样品细菌内毒素检查法的验证 取3个批号的供试品分别用BET水稀释15倍，使用λ=0.25 EU/mL的2个厂家的鲎试剂进行内毒素检查，并按要求做阳性(PPC、PC)、阴性(NPC、NC)对照，结果3批清开灵注射液的内毒素检查均符合规定。见表6。

表6 样品细菌内毒素检查结果

3 讨论

本研究所有表格中“+”表示阳性，“-”表示阴性。其判断标准是形成凝胶且倒转180°不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶不坚固、变形并从管壁滑脱者为阴性。

不同批次供试品对不同厂家的鲎试剂的干扰程度可能存在不同，为了避免因鲎试剂造成的判断失误。因此在干扰预试验中使用了2个厂家的鲎试剂，对3 个批次的清开灵注射液进行凝胶限度法内毒素检查，结果显示2个厂家生产的鲎试剂检验结果相同，同一厂家不同批次的供试品对鲎试剂的反应结果也无差异， 因此确定清开灵注射液的最大不干扰浓度为稀释15倍 。

目前《中国药典》2015年版并未收录清开灵注射液，也尚无国家标准对其进行细菌内毒素检查。采用传统的家兔法检查热原，成本高、时间长、影响因素多、灵敏度低。细菌内毒素检查法相比于家兔热原检查法，具有经济、快捷、灵敏和易于标准化的优点，受到了现代药品检验技术的青睐。因此，开展清开灵注射液内毒素检查法的研究有着重要的实际意义。

建议 将清开灵注射液质量标准中的热原检查项改为细菌内毒素检查项，规定每1 mL清开灵注射液中含内毒素的量应小于7.5EU。