滋脾通络颗粒对2型糖尿病大鼠早期肾病的保护作用

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1.海南省药物研究所，海南 海口 570311；2.海南省中医院，海南 海口 570216

糖尿病肾病作为一种由糖尿病引发的并发症，在发达国家占到了所有肾功能衰竭病例中的30%～40%[1]，由于2型糖尿病的人数增加，2型糖尿病肾病的发生数也逐年上升，其中20岁以上的糖尿病患病率高达9.7%，2013在我国糖尿病人数为9840万，居全球首位[2]。因此防控2型糖尿病肾病的形势可谓十分严峻。“滋脾通络汤”在海南省中医院长期作为院内制剂使用，为控制2型糖尿病早期肾病药物，疗效在临床已得到证实[3]，实验验证经过干燥制粒后的“滋脾通络颗粒”是否仍有药物功效，同时通过对大鼠2型糖尿病肾病模型的效果更直观的考察药物对大鼠肾脏的作用情况。

1 实验材料

1.1 受试药物 滋脾通络颗粒(8 g/袋，由黄芪、当归、赤芍、山药、牛膝、大黄、鬼箭羽、三七、水蛭、甘草水提液加辅料干燥制成，批号：20170801，海南省中医院提)；盐酸二甲双胍缓释片(批号：170807，山东司邦得制药有限公司)。

1.2 动物 SPF级SD大鼠，雄性，55只，体重(180±20)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2014-0011，动物饲养于海南省药物研究所SPF动物房，使用许可证号：SYXK(琼)2014-0025。

1.3 仪器 大鼠代谢笼，Accu-Chek Performa血糖仪(罗氏)，ST-360酶标仪(KHB)，WD-2103A洗板机，Eclipse 50i显微镜(Nikon )，7100 Automatic Analyzer血生化仪(Hitachi )，病理切片设备(Leica RM2235，EG1150H，EG1150C，HI1210/1220，TP1020)。

1.4 材料 ELISA试剂盒(批号：170711，上海恒远)，血生化试剂(Wako DF769，DG501)。

2 方法

2.1 模型动物的制备及分组 根据适用症模型，选择大鼠2型糖尿病模型进行造模，造模方式为链脲佐菌素(STZ)辅以高脂饲料喂养[4]。SD大鼠先以高脂饲料喂养21 d，禁食不禁水12 h，称量大鼠体重，并按照体重将STZ以25 mg/kg小剂量腹腔注射(i.p.)。注射完成后正常饮水，并继续给予高脂饲料喂养。于14 d测量空腹血糖(禁食8 h)，选取血糖浓度高于15 mol/L的大鼠。继续喂养14 d，收集24 h全尿液，尿白蛋白含量高于5 mg/d的大鼠可认为发生早期肾病[5]。

将2型糖尿病早期肾病成模大鼠50只随机分为5组，每组10只。分别为滋脾通络给药高、中、低剂量组，二甲双胍组，模型组。

2.2 给药及剂量 根据长期毒性试验剂量确定本次药效学研究剂量为7.5 g/kg，给药中剂量组及低剂量组分别为高剂量组剂量的1/2及1/4，即3.75 g/kg及1.88 g/kg(以成品计算)。高中低3个剂量组设置分别为60 kg人用剂量的9.37、4.69及2.34倍；若按照体表面积折算，则是相对大鼠等效剂量的1.52、0.76及0.38倍[3]。阳性药盐酸二甲双胍缓释片依据人用剂量平均1 g/d·60 kg折合为大鼠等效剂量约为1.0 g/kg(0.5 g×2片/60 kg×6.17系数≈1.0 g/kg)，按照大鼠日均饮水量磨碎后放入饮水中稀释，由大鼠自由饮取，每日更换新配药物饮水。模型组给予等体积生理盐水，滋脾通络3个剂量组均按照15 mL/kg体积灌胃给药。

2.3 观察指标 每周测量一次大鼠体重及空腹血糖(FBG)，比较各组大鼠差异。连续灌胃给药6周后，收集大鼠24 h尿液测尿白蛋白(UAER)；尿肌酐(Ucr)含量，麻醉大鼠腹主动脉取血测血清肌酐(Scr)，血清尿素氮(BUN)，利用公式求校正的内生肌酐清除率，公式如下：

内生肌酐清除率=(尿肌酐浓度×每分钟尿量)/血清肌酐浓度得到的结果除以大鼠体重即为每kg体重的肌酐清除率(Ccr)。

采集血清后，取大鼠双侧肾脏，10%甲醛溶液(福尔马林)固定，切片，HE染色法染色，观察光镜下的肾小球，肾小管病变情况。

2.4 统计方法 采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，方差齐以Dunnett-t检验各组与对照组之间的差异水平，方差不齐以Dunnett-T3检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠体重的影响 除二甲双胍组体重仍有增加外，其余各组体重均不同程度减轻。在第6周之后，滋脾通络颗粒给药高剂量组与模型组相比，体重增加差异具有统计学意义(P<0.05)。滋脾通络中剂量和低剂量相比模型组则差异无统计学意义(P>0.05)。阳性药盐酸二甲双胍对照组大鼠体重则在整个实验期间与模型组相比均有显著增加，差异有显著统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 滋脾通络颗粒对大鼠体重的影响 ±s)

注：与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01。

3.2 对大鼠FBG的影响 滋脾通络高、中剂量组分别在给药第3周、第4周FBG明显降低，和模型组同期FBG相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，至第6周与同期模型组大鼠相比，FBG值降低具有显著统计学意义(P<0.01)。滋脾通络颗粒低剂量给药组试验全程未见与模型组FBG的统计学差异。见表2。

表2 滋脾通络颗粒对大鼠FBG的影响 ±s)

注：与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01。

3.3 对大鼠Scr、BUN、UAER、Ccr的影响 滋脾通络高剂量给药组无论Scr、BUN、UAER均较模型组低，且差异具有显著统计学意义(P<0.01)，滋脾通络颗粒中剂量给药组Scr及UAER亦均较模型组低，差异具有统计学意义(P<0.05)，BUN与模型组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。低剂量组与模型组相比差异均无统计学意义(P﹥0.05)。滋脾通络颗粒高剂量组能够显著降低Ccr(P<0.05)，其余各组与模型组相同。见表3。

表3 对大鼠Scr、BUN、UAER、Ccr的影响 ±s)

注：与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01。

3.4 对大鼠肾切片外观的影响 由HE染色的肾小球切片可以看到，模型组大鼠肾小管上皮细胞明显扩张，胞浆疏松，出现水肿；肾小球体积明显增大，基底膜增厚，肾小球囊挤压消失。滋脾通络颗粒低剂量组与模型组表现相似，均出现明显DN特征。滋脾通络给药高剂量组与阳性药物盐酸二甲双胍缓释片组大鼠肾小球体积，肾小管上皮细胞较模型组均有明显缓解。滋脾通络中剂量组也有缓解DN症状特点。见图1。

4 讨论

本实验结果表明滋脾通络颗粒能够明显缓解糖尿病大鼠肾小球肥大等早期DN的主要病理改变，通过实验可见滋脾通络颗粒能够稳定空腹血糖在一个相对较低的水平，起到缓解肾脏负担，控制早期DN继续发展的趋势。经滋脾通络颗粒治疗的大鼠无论尿量还是每日的尿白蛋白含量均低于模型组DN大鼠，Scr及BUN含量也较DN模型组大鼠更低。经大鼠体重校正后的Ccr结果表明，与人类肾病发生后Ccr较正常值降低相反，肾病大鼠Ccr升高，这也与许多文献中报道的一致[7-9]，但具体是何原因导致大鼠Ccr与人类Ccr表象相反仍不清楚其中机理。经治疗后的大鼠Ccr较模型组低，滋脾通络高剂量组能显著降低Ccr水平。

处方中黄芪味甘性温为补气要药，取其大补脾胃之元气，使气旺以助血行；山药甘平，归脾肺肾经,既补三脏之气，又滋其阴，二药相合，气血双补，相配为君。当归、赤芍、川牛膝活血而不伤正，补血而不滞血。其中黄芪、山药、牛膝、大黄、水蛭成分可能具有抑制系膜细胞凋亡的作用[10]，黄芪、当归、赤芍、山药、牛膝、大黄、水蛭、甘草等的配伍具有益气活血利水作用，能够消退水肿，减少蛋白尿，延缓肾功能衰竭的速度[11]。鬼箭羽具有降低全血粘度，降低血糖，双向调节脂质代谢的作用[12]。综上，本处方药物在降糖，消水肿，降低蛋白尿等多方面作用于糖尿病早期肾病，具有综合的延缓糖尿病早期肾病病程作用。