黄芪补气养血合剂质量标准研究

唐斌斌，杜书君△，郝保华

（1.山东省聊城市阳谷县人民医院，山东 聊城 252300； 2.西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069）

黄芪补气养血合剂是阳谷县人民医院经过20余年临床实践总结的有效方剂，由黄芪、当归、补骨脂、白芍、女贞子、白术等10余味中药组方，有补气养血、健脾补肾功效，用于治疗气血亏虚、脾肾不足证引起的白细胞减少症及术后气血虚弱等症效果良好。两症属中医“虚劳”“气血虚”等范畴［1］，治疗多采用扶正固本之法。为了确保黄芪补气养血的质量稳定性和临床有效性，本研究中建立了制剂中黄芪、白芍和补骨脂的薄层鉴别方法，以及当归中阿魏酸含量的测定方法。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Agilengt 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；YP-5001型电子精密天平（上海良平仪器仪表有限公司）；YFX20／3+1型常压循环3+1一体煎药机（北京东华原医疗设备有限责任公司）；QH-2夹层锅（郭店前中不锈钢制品厂）；BSA224S型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。

试药：黄芪甲苷对照品（批号为110781-201616），芍药苷对照品（批号为110736-201438），补骨脂素对照品（批号为110739-201310），异补骨脂素对照品（批号为 110738-201313），阿魏酸对照品（批号为110773-201614），均购自中国食品药品检定研究院；黄芪补气养血合剂（批号分别为20170515，20170518，20170522，阳谷县人民医院制剂室自制）；乙腈和磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯；试验用水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

黄芪［2］302，［3-5］：取本品 20 mL，加水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液20 mL洗涤，弃去氨溶液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法［2015年版《中国药典（四部）》通则0502，以下简称“通则 0502”］试验，精密吸取上述 3 种溶液各 2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10℃以下放置分层的三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1A。

白芍［2］105，［6-7］：取本品 20 mL，加水饱和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液20 mL洗涤，弃去氨溶液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺白芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，精密吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，置105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。详见图1B。

补骨脂［2］187，［8-9］：取本品 20 mL，加乙醚 20 mL 振摇提取，取乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺补骨脂的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述4种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图1 C。

2.2 阿魏酸含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Thermo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.085%磷酸溶液（15∶85）；检测波长：316 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。理论板数按阿魏酸峰计应不低于2 000。

2.2.2 溶液制备

取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得对照品溶液。精密量取本品3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，滤液经0.22 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。取缺当归药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2.2项下3种溶液，按拟订色谱条件进样，记录色谱峰。结果供试品溶液和对照品溶液色谱在相同保留时间处有色谱峰，阴性无干扰，且分离度较好，表明方法专属性好。详见图2。

线性关系考察：精密吸取质量浓度为15 μg／mL的阿魏酸对照品溶液 1，2，4，8，12 μL，按拟订色谱条件分别进样测定，以阿魏酸进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝24 895X-45.323，r＝0.999 9（n ＝5）。结果表明，阿魏酸进样量在0.015 ～0.180 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为15 μg／mL的阿魏酸对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为0.83%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为20170515），分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样，测定阿魏酸的峰面积。结果的 RSD为1.02%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20170515）样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，按拟订色谱条件测定。结果阿魏酸的平均含量为 28.68 μg／mL，RSD 为0.98%（n＝6），表明方法重复性良好。

图2 高效液相色谱图

加样回收试验：精密量取已知含量（阿魏酸含量为28.72 μg ／mL）的样品 6 份，每份 1 mL，分别精密加入质量浓度为15 μg／mL的阿魏酸对照品溶液各2 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 阿魏酸加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

取3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，各精密吸取10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果批号为20170515，20170518，20170522的3批样品中阿魏酸的含量分别为 28.61，28.83，29.13 μg ／mL。

3 讨论

参考《中国药典》及有关文献，曾对该制剂中的主要药材进行薄层鉴别，其中黄芪、白芍、补骨脂的薄层鉴别斑点清晰，阴性对照无干扰。本研究中对党参进行薄层色谱鉴别，由于党参中主要成分为党参炔苷，极性较大，采用不同方法处理样品［2］281，［10-11］，均无法完全排除阴性干扰，故未建立党参的薄层色谱鉴别方法。

当归补血活血，为黄芪补气养血合剂的主要药味，对其指标成分阿魏酸进行了含量测定研究。阿魏酸极性较大，在热水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等溶剂中均有较好的溶解性，故供试品溶液制备方法可采用直接稀释法或萃取法［12］，本研究中采用甲醇直接稀释法，与药典所载70%甲醇提取法基本一致。测定阿魏酸含量时，考察了不同体系和不同比例的流动相［乙腈-0.1%磷酸溶液（17 ∶83）［13］、甲醇 -0.1% 磷酸溶液（30 ∶70）［14］、甲醇 -0.8% 冰醋酸液（22 ∶78）［15］］，色谱峰分离程度均不理想，经过多次试验，适当调整后，结果以乙腈-0.085%磷酸溶液（15∶85）为流动相得到的色谱峰分离度较好，阴性对照无干扰。

本研究中确立了黄芪补气养血合剂中黄芪、白芍和补骨脂的薄层鉴别方法及当归中阿魏酸的含量测定方法，试验结果表明，该方法操作简单，灵敏度高，重复性好，专属性强，可用于黄芪补气养血合剂的质量控制。