金黄色葡萄球菌总RNA提取的研究

朱晓丽，刘口妍，任峰，陆娟，吴亮

（1.泰州市人民医院 检验科，江苏 泰州 225300；2.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；3.江南大学附属医院（无锡第四人民医院），江苏 无锡 214062）

0 引言

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是临床重要致病菌，其耐药性近年来日趋严重，其中耐药甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Methicillinresistant Staphylococcus aureus, MRSA）分离率已高达50%以上。金黄色葡萄球菌能导致严重症状的原因在于其拥有各种毒力因子，包括溶血表、肠霉素和杀白细胞素等[1]。在临床治疗中迫切需要在感染早期开展各种毒力因子检测以避免各种严重感染并发症发生，提高患者生存率[2]。通过RT-PCR技术检测金黄色葡萄球菌毒力因子编码基因表达是一种最快捷简便的技术，但金黄色葡萄菌坚固细胞壁阻碍了常规方法提纯细菌总RNA[3]。本研究比较3种方法破坏金黄色葡萄球菌细胞壁效果，并获得最佳抽提总RNA方法，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 菌株

4株金黄色葡萄球菌分离于我院患者，经VitckⅡ Compact全自动细菌鉴定系统鉴定为金黄色葡萄球菌。各株细菌接种于3 mL LB液体培养基，经220转/分钟培养12 h用于细菌总RNA提取。

1.2 RNA提取

取1 mL过夜培养菌液，离心后去除培养基。分别采用3种方式提取细菌总RNA。

（1）Trizol直接提取。向菌液沉淀中加入1 mL Trizol，剧烈振荡30 s后严格按照试剂操作说明书提取总RNA，最终溶解于50 μL无核酸酶双蒸水中，用于后续研究。

（2）溶菌酶裂解后提取。向菌液沉淀中加入200 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL）于37℃孵育1 h后离心，收集沉淀使用Trizol提取总RNA用于后续研究。

（3）溶葡球菌酶裂解后提取。向菌液沉淀中加入200 μL溶葡球菌酶溶液（10 mg/mL）于37℃孵育1 h后离心，收集沉淀使用Trizol提取总RNA用于后续研究。

1.3 RNA质量鉴定

取5 μL总RNA提取产物，经1%琼脂糖电泳（120 V，20 min），观察RNA浓度和降解情况。

2 结果

3种方法提取RNA结果：采用Trizol法直接裂解细菌并抽提总RNA，其产物经琼脂糖电泳检测未发现RNA；采用溶菌酶预先裂解后使用Trizol法抽提细菌总RNA，其产物经琼脂糖电泳检测未发现RNA；采用溶葡球菌酶预先裂解后使用Trizol法抽提细菌总RNA，其产物经琼脂糖电泳检测发现RNA，且条带清晰无降解（见图1）。

图1 三种方法提取金黄色葡萄球菌总RNA效果

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，是引超食物中毒的主要病原菌，同时也引起人的多种感染性病疾，甚至造成危及生命的疾病，如肺炎、脑膜炎、心内膜炎和败血症等。由金黄色葡萄球菌所导致的各种疾病已是世界范围内影响公共卫生与健康的重要问题，开展细菌毒力因子检测可以有效地评估细菌致病力，为预防严重感染的发生提供技术支持[4]。

金黄色葡萄球菌外部具有坚固的细胞壁，常规方法如煮沸、冻融均无法有效破坏。Trizol试剂具有较强裂解哺乳动物细胞能力，但本研究中我们发现其对金黄色葡萄球菌无裂解效果。溶菌酶（lysozyme）是本实验中使用另一种裂解剂，该酶又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶[5]。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不可溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。虽然金黄色葡萄球菌细胞壁也是由β-1,4糖苷键构成，但本研究中发现普通溶菌酶无法破坏金黄色葡萄菌细胞壁，后续使用Trizol试剂无法提取出总RNA[6]。溶葡球菌酶（lysostaphin）也是本研究所使用的第三种裂解剂，该酶裂解金黄色葡萄球菌效果最佳。溶葡球菌酶是20世纪60年代从一株编号为NRRL B-2628的模仿葡萄球菌（S.simulan）中发现，该酶是一种含Zn2+的金属蛋白酶，具有催化葡萄球菌细胞壁肽聚糖五肽桥水解的强大活性，其抗葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌感染的药用潜力也受人们的重视[7]。我们的研究发现，金黄色葡萄不过经溶葡球菌酶处理20 min后，可以方便地使用Trizol提纯细胞总RNA，极大地方便临床开展金黄色葡萄球菌各种耐药基因和毒力基因表达检测和研究[8]。