慢性乙型肝炎肝组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞的表达与肝窦及窦间隙病理病变的相关性研究

汪琼，陈付凉

（1.蚌埠医学院第一附属医院 感染科实验室，安徽 蚌埠 233000；2.解放军第123医院 病理科，安徽 蚌埠 233000）

0 引言

慢性乙型肝炎发病和免疫功能具有密切相关性，免疫功能低下可能和患者的病毒无法清除有关，且机理较为复杂。细胞免疫于乙肝发病中有着重要作用，比如CD4+、CD8+细胞毒T淋巴细胞的增加对清除病毒有明显作用，而T细胞功能低下则是乙肝慢性化的关键因素，但尚无明确机制。肝窦及窦间隙作为评价慢性乙型肝炎的重要物质，其与肝炎组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞的表达可能有一定的联系。因此，为了进一步研究慢性乙型肝炎肝组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞的表达与肝窦及窦间隙病理病变之间的相关性，本文选择60例CHB肝脏组织标本和10例正常人肝组织标本进行对比研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究资料

随机选择2013年7月至2016年12月蚌埠医学院第一附属医院60例慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者肝脏组织穿刺标本，男41例，女19例；患者年龄在13-62岁，平均34岁,获取的肝组织长度在1.5-2 cm之间。选取正常肝穿刺组织10例，排除HBsAg阳性。所有病例诊断均符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[1]。

1.2 试剂

免疫组化试剂盒为美国Maxin Biotech Inc产品。

1.3 标本采集与处理

获得的60例CHB患者及10例正常肝组织制作病理切片，分别做苏木素-伊红染色（HE染色），CD4+、CD8+免疫组化染色，显微镜观察。

1.4 方法

（1）免疫组化染色。染色方法严格按照说明书进行。

（2）CD4+、CD8+细胞阳性判断方法。观察CD4、CD8在肝组织中单个核细胞的染色深浅及分布范围。不显色为阴性（-）。染成棕黄色呈散在分布为阳性（+），染色细胞数每个高倍视野（400倍）单个核细胞≤20。单个高倍视野阳性部位细胞数＞20，呈弥漫性或片状分布为强阳性（++）。每张切片随机选5个高倍镜视野，计算其阳性细胞数，取平均值。

（3）肝窦及窦间隙病理病变评分方法。我们选取肝窦阻塞、肝窦狭窄、肝窦毛细血管化三个指标来对肝窦的破坏进行评分。若无以上病变肝窦积分为0；有一种病变积分为1；有两种病变积分为2；三种病理表现都有积分为3。

2 结果

统计学方法应用SPSS 17.0软件处理数据，计数计量资料采用Pearson correlation统计学分析，P0.05被认为差异有统计学意义，见表1。

表1 肝窦病变积分与CD4+、CD8+阳性表达的关系

3 讨论

CHB发病是HBV侵入，机体的免疫系统在对抗病毒入侵所引起的全身免疫系统改变及肝组织损伤的过程。研究表明[2]，细胞免疫在CHB发病及慢性化发展过程中起核心作用，而CD4+、CD8+在介导细胞免疫过程中担当重要角色[3]。故机体肝组织中CD4+、CD8+的表达量，可能是机体细胞免疫状况的较好反应。之前有学者关于外周血T淋巴细胞表达与肝组织损伤的相关性报道，但结果亦不相一致。笔者通过免疫组化染色直接半定量检测肝组织中淋巴细胞亚群阳性率，观察CD4+、CD8+T淋巴细胞在肝组织中的表达与限定的肝内毛细血管（肝窦）病理形态学变化，分析两者之间存在的联系，进一步了解HBV感染慢性化的机制。之前鲜有学者关于此类报道。

CHB患者肝脏血管病变是肝组织损伤的重要特征[4]，肝血管病变导致肝脏血液循环障碍，对肝组织及机体造成损害。肝脏血管炎症导致其破坏及阻塞，引起血管增生、肝窦毛细血管化等肝血管的改建及结构异常，此过程多种免疫细胞参与介导，据研究表明[5]CD4、CD8是此过程中重要的分子基础。故检测肝组织中CD4、CD8表达，观察肝组织中肝血窦的病变，对判断患者的免疫状态和肝组织的损伤程度大有助益。肝血窦的通透性较大，有利于肝细胞与血流之间进行物质交换，肝血窦内肝巨噬细胞（Kupffer cell），有较强的吞噬能力，为肝内重要的防御装置。这与T细胞介导的免疫功能相近。正是肝窦的特殊结构及功能使其成为HBV经血液循环进入肝组织首先侵犯并复制的部位[4-5]。故CHB患者肝组织肝窦病理病变与T淋巴细胞表达可能存在一定联系。以此为线索，笔者对入选的60例CHB患者和10例正常肝穿刺组织免疫组化染色，分析肝组织T淋巴细胞表达与肝窦病理病变积分之间的关系。

虽然CHB发病及慢性化的具体机制还不明确，但有一点是医学界共识，HBV感染本身并不造成肝组织损伤，而是通过激发宿主免疫应答造成肝细胞毁损，肝组织损伤程度取决于病毒复制与及机体免疫应答和纤维化之间的稳态。有学者研究发现[6]，Tregs在外周血表达与肝组织炎症程度（G）（S）之间存在负相关性。但也有持不同观点的[7]，认为T淋巴细胞表达与肝组织炎症程度（G），和纤维化程度（S）无相关性。我们研究发现，肝组织损伤在血管表现肝窦病理病变积分随着CD4+、CD8+细胞阳性程度增强而加重（如图1、2），统计学相关性分析得出P0.01，说明两者之间存在显著相关性。与裴豪等关于肝组织损伤的研究结果[8]相近。我们还发现，在肝窦病变积分为0的13例标本中10例来至正常对照组，3例是CHB患者，同样T淋巴细胞表达阳性中亦有正常对照组标本，说明HBV侵入肝组织，T淋巴细胞已在肝组织中表达，感染初肝组织肝窦病理病变可无表现或病变较轻。这可能是CD4+、CD8+介导细胞免疫，在免疫抑制维持机体免疫稳态方面发挥作用。此期极少有临床表现，但病毒复制活跃。调节性T细胞（Tregs）T细胞亚群可有多种表现型，无论何种Tregs表型，其作用的机制之一是通过分泌IL-10，TGF-β（转化生长因子-β）等因子，抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞的过度活化和增殖[9]，发挥Tregs负性免疫抑制作用。可见CD4+、CD8+T淋巴细胞是Tregs维持机体稳态作用机制的最后通路。故肝组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞表达可较准确的反应机体的免疫状态。从实验结果看，肝窦病变积分为2的25例患者中，CD4+、CD8+T淋巴细胞表达阳性及以上者20例，占比80%，说明肝组织肝窦病变在形态学上有明显表现时，此时的肝组织T淋巴细胞表达较肝窦病变积分小者增强。此期机体免疫系统，特别是特异性细胞免疫系统发挥作用。

图1 （CD4+肝细胞表达）

图2 （CD8+肝细胞表达）

肝组织病理检查中我们发现，若肝组织结构破坏严重，肝组织纤维化，可见假小叶，已分辨不清典型肝窦及窦周间隙组织结构，其肝组织CD4+、CD8+T淋巴细胞很少表达，且患者年龄偏高。我们推测，CHB患者HBV复制与机体免疫长期博弈中，特异性细胞免疫未能将HBV彻底清除，进入反复期，致使肝组织大面积毁损。此时外周血可能无法准确反映肝组织病变情况，临床应尽早肝穿刺病理检查，以免延误病情。

综上所述，望本实验研究能为今后学者在CHB患者肝组织中T淋巴细胞表达与肝血管病变的研究方面提供帮助，为HBV慢性化机制提供佐证，为临床治疗CHB患者寻找合适方案。