β-淀粉样蛋白25～35诱导星形胶质细胞增殖模型

黄秀芳 陶彦谷 张茹兰 黄启辉 (广州中医药大学，广东 广州 50080)

阿尔茨海默病(AD)是中枢退行性疾病，β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集沉积成老年斑是AD的病理特征〔1〕，在AD患者大脑病理切片中发现明显的星形胶质细胞(AS)增生，尤其是围绕受损的神经元周围有强的AS反应。AS具有对各种损害产生强烈反应的特性，与神经元细胞相互作用，维持神经系统内环境的稳定，AS在AD的病理过程中呈现出清除Aβ的作用〔2〕，但随着病程进展，Aβ能够诱导AS增殖，产生致炎因子，导致神经元细胞损伤〔3〕，因此建立良好的AS培养模型对研究AD有重要作用。本研究探讨Aβ25～35诱导AS增殖的合适浓度，并研究AS的体外培养，为研究药物对AD的治疗作用提供细胞模型的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生1 d内的SPF级SD大鼠，体重5～6 g，为南方医科大学实验动物中心提供(合格证号:scxk粤2006-0015)

1.2 主要仪器 CO2细胞培养箱(Eppendorf)公司;常温台离心机(Themo公司);超净台(阿尔泰实验室设备有限公司);流式细胞仪(R＆D公司);荧光倒置显微镜(OLYMPUS公司);多功能酶标仪(Molecular Devices公司)。

1.3 主要试剂 Aβ25～35、噻唑蓝(MTT，sigma公司)，DMEM培养基、胎牛血清(Hyclone公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-DETA(吉诺生物医药科技有限公司)，兔抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多抗(Santa Cruz公司)，FTTC标记的羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，青霉素-链霉素溶液(Gibco公司)，聚丙烯酰胺凝胶(SDS，广州威佳科技有限公司)。Aβ25～35(1 mmol/L)储存液、MTT、三联溶解液配制5 mg Aβ25～35加入4.72 ml超纯水中，250 mg MTT加入50 ml PBS溶液中，完全溶解，另外，10 g SDS、5 ml异丁醇和 0.1 ml HCl(1 mmol/L)，用双氯水定容为100 ml，用0.22 μm滤膜过滤除菌后分装，Aβ25～35、MTT－20℃保存，三联溶解液 4℃保存。

1.4 AS的体外原代培养〔4〕新生24 h的SD大鼠，冰冻低温麻醉处死，乙醇浸泡5～10 s消毒后，在超净台取出完整大脑，在解剖显微镜下剔除蛛网膜、软脑膜及血管，取出双侧大脑皮层，冲后转移至盛有DMEM的离心管中，用移液管吹打10次，振荡60 s后，先后用70 μm及20 μm孔径过滤器各过滤两遍，最终滤液加入20%胎牛血清和1% 双抗溶液，吹打混匀，计数后以1×105的密度接种于6孔培养板中，培养板置于CO2培养箱中，饱和湿度、37℃培养，次日换成10% 胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液，继续培养5～7 d，每2～3 d换液一次，每次换液前稍加振荡，PBS溶液冲洗一遍。

1.5 细胞的传代培养 原代培养细胞长满80%～90%培养板底面时传代，传代前用PBS溶液冲洗两遍，加入少许胰蛋白酶-DETA溶液消化3 min，置于倒置显微镜下观察细胞形态变圆时，加含血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打使细胞从培养皿底面脱落，收集细胞悬液，以4×105的密度接种于6孔培养板中，继续培养，传代细胞4～5 d融合。

1.6 流式细胞技术鉴定GFAP 取3代细胞，按上述方法制成单细胞悬液离心5 min，PBS溶液漂洗3次，制成浓度为以 1×106/ml的细胞悬液，取200 μl，加抗GFAP多抗 1 μl(鉴定组)，并设同型对照，冰浴30 min，离心弃上清，PBS充分洗涤，加FTTC标记的羊抗兔IgG，避光反应15 min，重悬细胞，进行流失细胞仪检测

1.7 检测不同浓度Aβ对AS增殖的影响 取3代细胞消化重悬，以每孔4×104个细胞接种于96孔培养板中，24 h 后加入终浓度的 0、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200 μmol/L Aβ25～35(预先老化)，每组 5 孔，4 h后每孔加入20 μl的MTT(5 mg/L)，4 h后加入三联溶解液100 μl终止培养，37℃培养过夜后，以空白对照组(仅加药物、MTT溶液、三联溶解液)调零，酶标仪上585 mm测各孔吸光值(OD值)，分别计算各浓度的细胞增殖率。细胞增殖率(%)=各浓度OD值－空白组OD值/空白组OD值×100%)

1.8 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、S-N-K法。

2 结果

2.1 细胞生长情况及流式细胞计数仪检测AS比例24 h后，大部分细胞均已贴壁，光晕明显;培养4～5 d后，细胞数目逐渐增多、舒展，部分细胞接触融合;随着培养时间的延长，AS的比例越来越高，7～8 d后，以AS为主的细胞可铺满整个皿底，达到90%的融合。传代后的AS 6 h即可全部贴壁，胞突逐渐舒张;4～5 d长满整个皿底，AS比例进一步增高;连续传代3次，AS的胞体外形不规则，细胞铺展明显，成放射状，细胞核多偏于胞体的一侧，一般为椭圆形，胞质丰富，密度较低。见图1。

流式细胞仪检测发现送检细胞中几乎均为GFAP阳性，GFAP表达阳性的细胞比例为(97.494±0.618)%，而同型对照组为(1.664±0.511)%，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 原代培养AS的生长情况(脑皮质细胞，×40)

2.2 不同浓度Aβ25～35对AS增殖能力的影响 不同Aβ25～35浓度作用24 h，对AS增殖能力具有不同的影响(P＜0.01)，当 Aβ25～35浓度为 5～60 μmol/L时，AS的增殖率明显高于0 μmol/L组(P＜0.01);当Aβ25～35 浓度为 70、100、200 μmol/L 时，增殖率低于0 μmol/L 组，且在100、200 μmol/L 浓度时差异有统计学意义(P＜0.05)。其中当 Aβ25～35浓度为20 μmol/L时，AS的增殖率最高。见表1。

表1 Aβ25～35对AS增殖能力的影响 (，n=5)

表1 Aβ25～35对AS增殖能力的影响 (，n=5)

与 0 μmol/L 组比较:1)P＜0.05

组别 OD值 增殖率(%)0 μmol/L 组 0.357±0.014 0.00±4.01 5 μmol/L 组 0.421±0.011 18.049±3.1301)10 μmol/L 组 0.443±0.009 24.271±2.5811)20 μmol/L 组 0.454±0.023 27.298±6.4751)30 μmol/L 组 0.451±0.015 26.401±4.3191)40 μmol/L 组 0.438±0.012 22.870±3.3081)50 μmol/L 组 0.422±0.012 18.217±3.3771)60 μmol/L 组 0.390±0.009 9.361±2.3981)70 μmol/L 组 0.356±0.016 －0.336±3.531 100 μmol/L 组 0.298±0.013 －16.536±3.5311)200 μmol/L 组 0.279±0.009 －21.917±2.5891)F/P值 103.107/0.000

3 讨论

GFAP是AS的骨架蛋白，可作为特征性标志物，作为AS的成熟标志〔5〕，本实验提示大多数细胞GFAP阳性，说明AS纯度较高，电镜下提示AS生长情况良好，这与本文采用震荡涡旋的方法使细胞混悬为单细胞悬液，避免胰酶残留影响细胞活力，其次采用不同孔径的滤网滤过细胞原液，进一步去除成纤维细胞的干扰，还采用无黏附底物环境培养，以减少神经元细胞干扰有关。

AD病理变化的实验模型一直是AD研究的难点，转基因技术为AD动物模型的制作和应用提供了广阔前景，但成本昂贵，Kerokoski等〔6〕证明低剂量的Aβ1～42作用 AS后，能够促进 AS 增殖，Frozza等〔7〕研究证实，Aβ25～35与Aβ1～42诱导神经细胞损伤的程度相似，本实验证明在 5～60 μmol/L浓度范围内Aβ25～35作用24 h，对细胞没有直接毒性，且对AS增殖具有促进作用，当Aβ25～35浓度为20 μmol/L时，AS的增殖能力最强，故可采用 Aβ25～35 20 μmol/L，24 h建立Aβ诱导AS增殖模型，为研究防治 AD病提供实验模型依据。