胆管癌组织中c-Met、Gab1的表达及意义

李志锋 石荣亚 霍 曼 孙明德 (保定市第一医院普外科，河北 保定 071000)

胆管癌是临床常见的恶性肿瘤之一，多起病隐匿，病情进展迅速，预后差，严重威胁人类健康。近年来分子生物学标记物的研究为肿瘤的早期诊断与治疗提供了契机。原癌基因c-Met的编码产物是肝细胞生长因子(HGF)的细胞膜受体，属酪氨酸激酶受体〔1〕，在细胞内信号转导中发挥重要作用，Gab蛋白是一类接头蛋白，该家族蛋白因能与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)相结合而得名。Gab1蛋白在Gab家族中含量最多、分布最广，在肿瘤的发生、发展中起重要作用〔2〕。本研究检测胆管癌组织及其癌旁组织中 c-Met、Gab1的表达情况，同时探讨 c-Met、Gab1蛋白表达与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般材料 收集保定市第一医院2008年3月至2015年 6月胆管癌标本 52例，年龄 39～72(平均62.8)岁;男29例，女23例;高分化20例，中分化18例，低分化14例;Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例;其中28例有淋巴结转移，24例无淋巴结转移;收集30例距胆管癌组织2 cm处经病理学证实的非癌胆管组织作为对照组。

1.2 方法 所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。切片脱蜡水化，浸于枸橼酸盐缓冲液经中火档微波处理行抗原修复。然后按照严格按照SP试剂盒说明、操作流程规范进行。兔抗人c-Met多克隆抗体和兔抗人Gab1多克隆抗体购自上海研生生物公司，SP免疫组化染色试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定 c-Met的阳性染色为胞质出现黄色、棕黄色或棕褐色为阳性颗粒，Gab1的阳性染色为细胞膜和细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒，每张切片随机在高倍镜下(×400)选择不同的5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，根据阳性细胞数量及染色强度，用半定量评分法对实验结果进行判定:①着色强度:无着色为0分，淡黄色为1分;棕黄色计2分;棕褐色计3分。②阳性细胞数在计数细胞中所占百分比:阳性细胞≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两者分值相加:0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(-)，6～7分为强阳性(+)。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行χ2检验，Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 c-Met、Gab1在胆管癌组织中的表达 c-Met在52例胆管癌组织中，40例(76.9%)呈阳性表达;在30例癌旁胆管组织中，4例(13.3%)呈阳性表达。Gab1在52例胆管癌组织中，36例(69.2%)呈阳性表达;在30例癌旁胆管组织中，5例(16.7%)呈阳性表达。c-Met、Gab1在胆管癌组织中的表达均明显高于在癌旁胆管组织(P＜0.05)。

2.2 胆管癌中c-Met、Gab1表达与临床病理因素的关系 见表1。

表1 c-Met、Gab1在胆管癌不同临床病理特征中的表达(n)

c-Met、Gab1在胆管癌组织中免疫组化表达阳性率与患者性别、年龄、分化程度差异无统计学意义(P＞0.05);c-Met表达阳性率与肿瘤分期、有无淋巴结转移呈正相关，Gab1表达阳性率与肿瘤分期呈正相关(均 P＜0.05)，Gab1与淋巴结转移无相关性(P＞0.05)。

2.3 c-Met和 Gab1在胆管癌中相关性 c-Met和Gab1在胆管癌组织中表达呈正相关(r=0.327，P＜0.05)。

3 讨论

c-Met是原癌基因c-Met编码的蛋白质产物，c-Met基因位于人类第7号染色体7q21-q31，包含21个外显子和20个内含子。c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的细胞膜受体，由 1条 50 kD的 α亚基和140 kD的β亚基组成，其中α链为胞外部分，β链分为胞外区、跨膜区和胞内区，α链和β链N端的胞外区作为配体共同参与与配体HGF的结合，而β链的C端位于胞质内，具有酪氨酸激酶活性。HGF是一种多功能生长因子，HGF可通过诱导有丝分裂和细胞运动，通过各种信号通路促进细胞分化、迁移〔3〕。c-Met在胆管癌中的作用是通过交错复杂的信号通路完成的，c-Met蛋白与HGF结合后，激活受体胞内蛋白激酶结构域中的酪氨酸蛋白激酶(PTK)，受体自身的酪氨酸残基磷酸化，进而导致多种底物蛋白磷酸化，如磷酯酶 C-γ(PLC-γ)、磷脂酸肌醇 3 激酶 (PI3K)、Gab1、Grb2等含有Src同源区的分子，引起下游信号通路，如Ras/MAPK，PI3K/Akt和 STAT 等的激活〔4〕，调节细胞的增殖、分化、运动等多种过程，从而引起肿瘤细胞侵袭性增强和抗凋亡，肿瘤血管生成、增殖，最终发生转移。c-Met广泛表达于人体正常组织，而在多种恶性肿瘤的发生、发展或转移过程中有过表达和基因扩增现象〔5，6〕。马桂芳等〔7〕采用免疫组织化学法、real-time PCR法研究c-Met在胃癌组织中的表达，结果发现c-Met在胃癌组织中的阳性表达率和c-Met mRNA明显高于对照组，c-Met蛋白表达与胃癌的淋巴结转移、临床TNM分期相关，认为c-Met在胃癌的发生、发展过程中发挥重要的作用。Kwon等〔8〕通过抑制c-Met介导的信号通路可限制卵巢癌细胞的生长和迁移。

Gab1是Gab蛋白家族的重要成员，Gab1基因定位于人4q31.1染色体上。Gab1具有促进细胞生长和分化、控制凋亡等多种生物学功能。Gab1蛋白位于细胞质中，一旦被受体磷酸化而激活，Gab1蛋白的近氨基端的 PH结构域与胞膜上的三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)相结合，从而把Gab1蛋白招募到细胞膜上，此过程依赖于MAPK对 Gab1蛋白的磷酸化〔9〕。Gab1蛋白与细胞膜的结合增加其与受体分子相互作用的机会及作用持续时间，保证细胞内信号传递持久稳定。Gab1蛋白可通过自身的 Try627和 Try659结合并激活蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，形成Gab1-SHP2复合物，激活下游Ras-Erk/MAPK信号转导通路，启动转录及相关蛋白翻译，促进细胞的增殖、分化〔10〕。Gab1蛋白含有YXXM序列的3个酪氨酸磷酸化位点能够结合PI3K的p85亚基，这一过程需要 PH结构域与PIP3的相结合。Gab1蛋白与p85亚基结合后激活PI3K，参与调节PI3K-Akt信号转导途径。Gab1蛋白还可与具有YXXP序列的信号分子的 SH2结构域结合等。被Gab1蛋白激活的各个信号转导途径之间相互关联、互相作用，共同调控细胞的增殖、分化和凋亡等生物学行为。许多原癌基因如 Tpr-Met、gp55及SFFV，可以通过Gab1传递信号，Gab1通过参与或上调原癌基因表达，放大与肿瘤生物学行为相关的信号转导通路。Gab蛋白家族中仅Gab1蛋白含有Met耦联序列(MBS)。Gab1蛋白通过MBS直接与HGF受体c-Met相结合而被激活，进而引导c-Met进入细胞核，激活下游信号转导通路，促使细胞趋化、迁移，实现肿瘤的浸润、转移〔11〕。本实验显示，c-Met表达与胆管癌分期、有无淋巴结转移正相关，Gab1表达与胆管癌分期相关。c-Met和Gab1在胆管癌的发生、发展中具有协同促进作用。