桃胶多糖的制备、质量表征及利尿作用研究

任永申，张霏霏，白 杰，刘 鹏，雷 蕾，刘新桥

（中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074）

桃胶是桃树蔷薇科植物桃 Prunus persica（L.） Batsch或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的树干受损伤如虫咬、切伤等或致病后分泌出来的胶质半透明物质，经过阳光暴晒或自然风干等途径获得的固态物质称为原桃胶，呈半透明的棕黄色[1].桃胶属树胶类物质，主要成分为多糖，其多糖含量高达90%以上，具有多糖类物质的一般性质.《唐本草》记载:“桃胶，味甘苦，平，无毒，主下石淋，破血，中恶疰忤”.《本经逢源》指出“桃树上胶，最通津液，能治血淋、石淋”.现代研究证实多糖的药理作用十分广泛，具有提高免疫、抗肿瘤、清除自由基、抗衰老、抗感染、降血脂、降血糖等作用，但对其利尿通淋作用尚缺乏研究.同时，由于原桃胶在水中的溶解度较低，因而限制了其广泛应用[2].为了提高其溶解度以及保护生物、化学和物理性质，本文采用水提醇沉法制备水溶性桃胶多糖，采用DNS法测定多糖并含量，并采用红外光谱法测定桃胶多糖化学特征图谱，并采用水负荷模型考察其利尿作用，以期为桃胶的药效作用研究及开发利用提供新的科学依据[3].

1 实验材料

1.1 药品

原桃胶（购自亳州药材市场，由中南民族大学药学院刘新桥副教授鉴定为桃 Prunus persica（L.）Batsch的胶状分泌物）.

1.2 动物

KM小鼠，雌性，体重20～22 g，由湖北省疾病预防控制中心提供，动物许可证号:SCXK（鄂）2015-0018.小鼠饲养于SPF级动物实验室，自由采食饮水，执行12小时明暗循环，室温23～25℃，相对湿度40%～70%.

1.3 试剂

D-木糖对照品（50mg/支，中国食品药品检定研究院），DNS试剂实验室自制，呋塞米片（规格为20mg/片，江苏亚邦爱普森药业有限公司），Na试剂（批号:20180702），K 试剂盒（批号:20180714），Cl试剂盒（批号:20180714），超微量 ATP 酶（Na＋-K＋-ATP酶）测试盒（批号:20180714），以上试剂盒全购自于南京建成生物工程研究所.

1.4 仪器

全波长酶标仪（Multiskan Go，赛默飞世尔科技公司），傅立叶变换红外 （FTIR）光谱（Thermo Fisher Scientific），旋转蒸发仪（RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂），UV-8000型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）.

2 方法

2.1 桃胶多糖样品制备

称取原桃胶50 g，用打粉机打磨成粉，过80目药典筛，用所筛桃胶粉按料液比1:100进行蒸馏水回流提取.首先，将过筛后的桃胶粉与蒸馏水按1:100料液比于60℃烘箱中浸泡30 h（浸胀完全），之后加热回流煮沸5 h.随后用多层纱布连续抽滤两次桃胶水解液，除去不可溶的杂质.将抽滤所得的桃胶水解液浓缩至原体积的1/5，采用Sevag试剂（氯仿:正丁醇＝4:1）多次萃取，除去蛋白；然后水浴加热去除蛋白的桃胶水解液，用30%H2O2脱色至无气泡产生后，再次浓缩至原体积的1/5；再用90%的乙醇沉淀过夜，8000 rpm/min离心20 min，得沉淀，即为桃胶多糖（Peach Gum Polysaccharides，PGP）；将桃胶多糖置于60℃烘箱中烘干，粉碎，贮存备用[4].

2.2 桃胶多糖含量测定与化学指纹图谱建立

2.2.1 桃胶多糖的含量测定

（1）D-木糖标准曲线的绘制

精密称取干燥恒重D-木糖适量，加水溶解，配制成 400.0 mg/L，精密移取木糖对照液 0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置于具塞试管中，分别加水至2 mL，加入1.5 mLDNS试剂，摇匀，于沸水中浴中加热5 min，取出后迅速冷却，于500 nm下测定其吸光度.以对照品浓度与吸光度值作标准曲线.

（2）多糖含量的测定

称取适量干燥的桃胶多糖粉末，加水配制成400 mg/L，精密移取0.5 mL置具塞试管中，加水至2 mL，加入1.5 mLDNS试剂，摇匀，于沸水中加热5 min后迅速取出，并于5000 nm下测定其吸光度.代入上述标准曲线中即得多糖含量.

2.2.2 桃胶多糖的红外光谱指纹图谱建立方法

取干燥的桃胶多糖粉末2 mg，与KBr粉末混合压片制样，FT-IR对样品在400～4000 cm-1范围内进行扫描，得到图1所示的红外光谱图.

2.3 桃胶多糖的利尿作用研究

小鼠适应性饲养三天后开始实验.实验前取健康小鼠，预先置于代谢笼中使其适应环境，灌胃给予生理盐水（剂量为0.1 mL/10g），观察自由饮水条件下动物尿量是否稳定.收集3 h内尿量，挑选尿量达到灌入纯净水量40%以上的动物，用于利尿实验研究.

实验前称量小鼠体重，选取20～25 g健康昆明小鼠25只，随机均分为正常组、呋塞米对照组（30 mg/kg），桃胶多糖高（6 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）剂量组，每组5只.动物禁食不禁水15 h，每只给予腹腔注射生理盐水1 mL，30 min后各组别按照组别所对应的剂量灌胃给药[5].给药后轻轻压迫小鼠下腹（膀胱所对应的位置），排尽膀胱中余尿，然后将小鼠置玻璃漏斗中，上方盖上培养皿厚盖，漏斗尖嘴插入锥形瓶中，用以收集尿液.每间隔1 h即开始收取小鼠尿液，此过程共进行4 h，连续进行6 d.记录每1小时所对应小鼠的尿量，随后3 500 rpm/min离心10 min，冻存于-80℃冰箱中，备用[6-7].收集最后一天给药后4 h内的总尿液，按各试剂盒方法测史各组小鼠尿液电解质钠、钾、氯离子浓度，肾脏Na＋-K＋-ATP酶活力.

3 实验结果

3.1 PGP多糖含量测定结果

由木糖对照品的吸光度和浓度作图，得标准曲线Y ＝ 0.0019X ＋ 0.1386 （R2＝0.9991）（eq1）.通过计算，得桃胶多糖的含糖量为96.30%，提示制备得到的桃胶多糖纯度较高.

3.2 PGP红外指纹图谱测定结果

红外光谱显示，在波数3 398.57 cm-1处的强吸收峰为-OH的伸缩振动，2 933.73 cm-1处为-CH2的非对称伸缩振动，而在1 624.06 cm-1带有许多小锯齿状的中强度吸收峰，为桃胶多糖中-CHO的特征吸收峰.1 419.61-1 200.00 cm-1之间有较大的锯齿状吸收峰，说明有苯环的三个特征骨架振动，而在1 043.49cm-1处有较强吸收峰，表明有C-O-C的伸缩振动.

图1 桃胶多糖的红外光谱图Fig.1 FT-IR spectrum of PGP

3.3 PGP的利尿作用

与正常对照组比较，桃胶多糖各不同给药组和呋塞米组在小鼠给药后 1 h内尿量明显增加 （P＜0.01）；桃胶多糖高、中剂量组在小鼠给药2 h后尿量也明显增多（P＜0.001，P＜0.05）；2 h过后，呋塞米组和桃胶多糖低、中剂量组相比于空白组无显著增加，说明这几组对小鼠尿量增加无稳定持续的利尿作用；而桃胶多糖高剂量组（6 g/kg）小鼠给药后4 h内尿量明显增加（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05），表明桃胶多糖具有明显且持续的利尿作用.桃胶多糖各剂量组在小鼠给药后0～1 h的尿量与呋塞米组比较有显著性差异（P＜0.05），表明桃胶多糖利尿作用较呋塞米缓和.桃胶多糖高剂量组相比于呋塞米在2-3 h具有显著性差异（P＜0.05），表明桃胶多糖高剂量组对小鼠的利尿作用持续时间较长.综上，可以得到桃胶多糖各给药组的利尿作用则较为均匀持久，且对机体的刺激性相比于呋塞米来说也较小.结果见表1.

表1 不同剂量PGP对小鼠利尿作用结果Table 1 The diuretic effect of different doses of PGP in mice

3.4 PGP对小鼠尿液电解质 Na＋、K＋、Cl－的影响

与空白对照组比较，PGP各不同剂量组和呋塞米皆可以显著增加小鼠尿液中的Na＋含量（P＜0.01或P＜0.05），在K＋排量上，在 Cl－排量上，与空白组相比，各给药组都无显著性差异，但呋塞米相比于空白组而言其Cl－含量有所升高，由于小鼠之间个体差异的影响，未能较好体现出呋塞米排Cl－的作用.而PGP各不同剂量组对小鼠尿液中Cl－排量无较大影响.结果见表2.

3.5 桃胶多糖不同剂量组对小鼠肾脏Na＋-K＋-ATP酶活力的影响

与空白组相比，呋塞米给药组肾脏组织中Na＋-K＋-ATP酶活力有显著性差异（P＜0.05），其余各桃胶多糖不同剂量组无显著性差异，结果如表3.

表3 PGP不同剂量组对小鼠肾脏Na＋-K＋-ATP酶活力的影响Table 3 Effects of different doses of PGP on Na＋-K＋-ATPase activity in mice kidney

4 讨论

中药利尿通淋药常用于治疗水湿壅盛型癃闭、淋浊、水肿、泄泻等[8]，是探索开发利尿药的重要依据.本文制备得到纯度较高的桃胶多糖，水溶性较好，色泽均匀，并对其含量和化学特征图谱进行测定，对质量进行表征，有利于后期产品的开发.传统文献记载桃胶具有利尿通淋作用，但其主要成分桃胶多糖的利尿作用及其机制尚未报道，本研究选取尿量、尿液离子、Na＋-K＋-ATP等指标对PGP利尿作用及机制开展探索研究[9].结果表明，PGP低、中、高剂量组对于生理盐水负荷小鼠均有较明显的利尿作用，且作用较为均匀持久，不会导致体内电解质紊乱且不受体内酸碱平衡变化的影响.

呋塞米为髓袢利尿药[10].呋塞米在1～2h利尿作用较明显，属于强效利尿药，这一点也得到了证实（如表1），但该种药物可导致低血钾、低血钠等副作用.从表2中可以看出，随着PGP剂量的增加，小鼠尿液中的Na＋含量是下降的，而其对Cl－排出量无影响.呋塞米组的 Na＋、Cl-排出量及 Na＋/K＋值均显著升高，说明3种离子的损失都较为严重，易出现低钠低钾血症[11].随着临床广泛应用，其配伍禁忌与不良反应的报道逐渐增多[12-13].对比临床常用利尿药呋塞米，PGP对动物Na＋/K＋值基本上与空白对照组相等，说明了对小鼠尿液中Na＋、K＋排出无明显干扰，可以避免机体电解质紊乱，其对于生理盐水负荷小鼠可通过促进Na＋、K＋、Cl－的排出，以维持体内水电解质的平衡[14].

细胞内外钠和钾离子的交换是通过 Na＋-K＋-ATP酶来进行的，它有利于维持细胞内 Na＋、K＋浓度的相对恒定、保持细胞内外环境适当的渗透压平衡.实验结果表明，PGP对肾脏组织Na＋-K＋-ATP酶活力没有显著影响，另一方面，PGP给药组的Na＋/K＋值和空白组相差不大，无显著性差异，综合说明了PGP的利尿作用与改变细胞内外渗透压无明显的相关性.另一方面，PGP可能是通过调节胃肠蠕动、消化液的分泌、消化道对水的吸收等其他途径实现的[15].

综上，现今在临床上经常使用的利尿药大多数以呋塞米，噻嗪类等为代表的一系列传统化学药物，这些药物在发挥利尿作用的同时也经常会产生一些不良反应（如引起电解质代谢紊乱、肝肾毒性等）[16].桃胶多糖与传统化学药物比较，不引起机体电解质紊乱，不良反应轻，作用持久温和，具有较好的开发前景，可进一步对其多糖成分进行研究，为开发中药利尿药提供实验依据.