多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)XZ-2发酵条件优化的研究

王 波,王 幸,周兴根,黄忠勤,丁震乾,常 勇,周涧楠,苏在兴

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏 徐州 221131)

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)是一种产芽孢的G+细菌,由于其具有植物病害防治、促进植物生长、对人和动植物无致病性并且无污染等优点而受到重视,美国环保署(EPA)将其列为可在商业上推广应用的微生物之一[1],我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种[2]。近年来,关于多粘类芽孢杆菌用于植物病害生物防治的报道越来越多,例如：胡飞等研究发现多粘类芽孢杆菌对水稻纹枯病有较好的防治效果[3];李峰等筛选到1株对小麦赤霉病菌有抑制作用的多粘类芽孢杆菌菌株[4];林营志等筛选并鉴定了4株生防多粘类芽孢杆菌,其中菌株FJAT-4539对香蕉枯萎病有很强的抑制作用[5];宋顺华等发现多粘类芽孢杆菌对西瓜枯萎病具有较好的防治效果[6-7]。多粘类芽孢杆菌XZ-2是本课题组从江苏省徐州市铜山区班井村大豆植株中分离筛选出的,该菌株具有广谱抗真菌活性,对多种病原菌如大蒜叶枯病菌[Pleosporaherbarum(Pers.ex Fr.) Rabenk]、黄瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、甘薯黑斑病菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)、丝瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)、甜瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporum(Schl.) f. sp.melonis]、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麦纹枯病菌(RhizoctoniacerealisVander Hoeven)、棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、大豆疫霉病原菌(Phytophthorasojae)、大豆炭疽病原菌(Soybeananthracnose)、大豆菌核病原菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]等均具有较强的抑菌活性(另文发表)。基于该菌株的广谱抗菌活性,我们初步认为该生防菌株具有较好的应用前景。本文采用单因素实验设计和正交实验设计相结合的方法,对多粘类芽孢杆菌菌株XZ-2的培养基配方及培养条件进行了优化研究,以期为该生防菌株的大规模生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

多粘类芽孢杆菌XZ-2从江苏省徐州市铜山区班井村大豆植株中分离,经江苏徐淮地区徐州农业科学研究所大豆课题组筛选鉴定后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 培养基

多粘类芽孢杆菌XZ-2菌株发酵基础培养基使用LB液体培养基(胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、蒸馏水1000 mL, pH 7.0),在121 ℃高压蒸汽下灭菌20 min。菌株活化采用LBA固体培养基(上述LB液体培养基+琼脂粉15 g/L)。

1.3 菌体生物量的测定

采用酶标仪(Thermo Multiskan GO, USA),取300 μL发酵液于酶标板中,以LB液体培养基为对照,测定OD600值,以OD600值作为判断菌体生物量大小的标准,OD600值大则菌量大[8]。

1.4 培养基成分的优化

碳源:以LB液体培养基为基础培养基，分别用酵母提取物、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉作为碳源,制成含有10 g/L单一碳源的LB液体培养基(100 mL/250 mL)。将活化后的菌悬液以5%(体积分数)分别接种到不同碳源的液体培养基中,置于28 ℃、180 r/min转速摇床中培养24 h后取出,在酶标仪上测定OD600值,每个处理3次重复。

氮源:采用赖氨酸、蛋白胨、磷酸二氢铵、氯化铵和L-天冬酰胺，分别制成含10 g/L单一氮源的LB液体培养基；其他接种、培养和测定方法同上,每个处理3次重复。

无机盐:分别向LB液体基础培养基中加5 g/L的硫酸锌、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钾；其他接种、培养和测定方法同上,每个处理3次重复。

多因素正交实验:以单因素实验筛选出的最佳碳源蔗糖、最佳氮源蛋白胨以及无机盐硫酸镁和氯化钙等4个变异因素,采用如表1所示的L9(34)正交表进行培养基优化试验,培养基pH值为7.0,在发酵温度为28 ℃、转速为180 r/min的摇床中振荡培养24 h,以OD600值分析4因素3水平对菌体生物量的影响,确定培养基的最佳配方,每个处理3次重复[9]。

表1 L9(34)正交实验设计因素 g/L

1.5 发酵条件优化

单因素实验设计参考赵爽等的设计方法[10-12],在优化得到的培养基基础上,分别对培养基的初始pH值、发酵温度、发酵时间、摇床转速、装液量以及接种量进行进一步优化。用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH将培养基的初始pH值调成4、5、6、7、8、9,每个处理装液量为150 mL,然后接种5%的菌悬液,在转速180 r/min、发酵温度28 ℃条件下摇培24 h后测定OD600值。将发酵温度设置为20、25、30、35、40、45 ℃,接种量、转速和培养时间等其他条件及测定方法同上。将发酵时间设置为12、24、36、48、60、72 h,其他培养条件不变。将转速设置为90、120、150、180、210、240 r/min,其他培养条件不变。在250 mL三角瓶中分别装培养基40、60、80、100、120、140 mL,其他培养条件不变。按体积分数将接种量设置为1%、3%、5%、7%、9%、11%,其他培养条件不变,分别测定OD600值,每组试验设置3次重复。

1.6 数据统计分析

采用Excel软件处理实验数据和作图,采用生物统计分析软件DPS进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 多粘类芽孢杆菌XZ-2的培养基优化

分别以酵母提取物、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉作为碳源,研究它们对多粘类芽孢杆菌XZ-2生物量的影响。结果如图1所示,在供试的5种碳源中,蔗糖作为碳源时XZ-2的生长量最大,其发酵液OD600值达到0.805,与其他4种碳源培养基上得到的生物量呈极显著差异;其次是葡萄糖和可溶性淀粉,其OD600值分别为0.626和0.586;以麦芽糖和酵母提取物作为碳源的培养基上得到的生物量较小,其OD600值分别为0.428和0.327。因此选取蔗糖作为最佳碳源。

图中不同大写字母表示1%极显著水平差异。下同。

由于有机氮源成本较高,因此本研究以无机氮源为主,结果如图2所示。菌株XZ-2在以蛋白胨作为培养基的氮源时生物量最大,其OD600值为0.677,与其他4种氮源条件下培养获得的生物量呈极显著差异;其次为磷酸二氢铵和氯化铵,其获得的OD600值分别为0.423和0.286;而在以L-天冬酰胺和赖氨酸为氮源的培养基上获得的生物量较小,其OD600值分别为0.139和0.053。因此选取蛋白胨作为培养基的最佳氮源。

图2 不同氮源对多粘类芽孢杆菌XZ-2生长的影响

分别以硫酸镁、氯化钙等5种无机盐制备培养基,发酵结果如图3所示。以硫酸镁和氯化钙为培养基的无机盐时OD600值较高,分别为0.568和0.553,与其他3种无机盐培养基培养获得的生物量呈极显著差异；以硫酸锌和硫酸锰为培养基的无机盐时,OD600值很小,菌株生长非常缓慢。由于以硫酸镁和氯化钙作为无机盐的条件下该菌株的生长量没有极显著差异,因此下一步采用硫酸镁和氯化钙作为培养基的复合无机盐。

图3 不同无机盐对多粘类芽孢杆菌XZ-2生长的影响

2.2 正交实验培养基成分优化

从表2、表3中可以看出：不同水平的蔗糖和蛋白胨对XZ-2的生长量有一定的影响,具体表现为蔗糖和蛋白胨的浓度越高,XZ-2的生长量越高,极差分别为0.141和0.088;不同水平的硫酸镁对XZ-2的生长量也有一定的影响,XZ-2的生长量随着硫酸镁浓度从3 g/L增加到5 g/L而不断增加,但当硫酸镁浓度从5 g/L增加到7 g/L时XZ-2的生长量反而下降,极差为0.073;不同水平的氯化钙对XZ-2生长量的影响表现为随着浓度升高而下降,极差为0.051。结合正交实验结果,确定该菌株的最适发酵培养基成分为:蔗糖15 g/L,蛋白胨15 g/L,硫酸镁5 g/L和氯化钙3 g/L。

表2 培养基组分正交实验统计结果

注：括号外为设计的水平值，括号内为设计的实际浓度值(计量单位为g/L)。

表3 培养基组分正交实验评价结果发酵液的OD600值)

注: K1、K2、K3分别代表蔗糖、蛋白胨、硫酸镁和氯化钙的3种水平与其他因素组合时XZ-2发酵液的OD600值。

2.3 XZ-2培养条件的优化

2.3.1 初始pH值的优化 由图4a可见,不同初始pH条件对多粘类芽孢杆菌XZ-2的发酵有一定的影响。具体来说：当pH值为4～8时,XZ-2菌株的生长量呈上升趋势；当pH值为8时,XZ-2发酵液的OD600最大,达到0.727;但pH值在6～8条件下发酵液的OD600值差异较小;当培养基初始pH值为9时,该菌株的生长量极低。因此,多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵培养基的最佳初始pH值为8。

2.3.2 培养温度的优化 图4b表明温度对多粘类芽孢杆菌XZ-2的生长有较大的影响。当温度为20～30 ℃时,随着温度的升高菌株XZ-2的生长量快速升高；当温度为30 ℃时,XZ-2发酵液的OD600值达到最大，为0.784;当发酵温度在30～45 ℃时,随着温度升高菌株的生长量逐渐降低,且在45 ℃条件下生长量极低。因此,确定30 ℃为该菌株的最佳发酵温度。

2.3.3 培养时间的优化 由图4c可见：XZ-2菌株在培养时间为12～24 h时,发酵液的OD600值显著升高,摇培24 h时发酵液的OD600值高达0.715;继续摇培后发现菌株的生长量逐渐下降。由此,我们认为该菌株的最佳发酵时间为24 h,该结果与菌株XZ-2的生长曲线结果一致。

2.3.4 装液量的优化 不同的装液量对菌株XZ-2的发酵有一定的影响,结果如图4d所示,在250 mL三角瓶中,XZ-2的生长量随着装液量的增加而增加,当装液量达到80 mL时,XZ-2发酵液的OD600值最高,为0.811;随着装液量继续增加,XZ-2发酵液的OD600值逐渐下降,但下降趋势较小。因此,选择250 mL三角瓶装液80 mL为菌株XZ-2的最佳装液量。

2.3.5 接种量的优化 接种量对菌株XZ-2发酵的影响如图4e所示,当接种量从1%增加到3%时,XZ-2发酵液的OD600值快速升高,当接种量在3%时,XZ-2发酵液的OD600值最大,为0.818；随着接种量继续增加,XZ-2发酵液的OD600值逐渐下降。说明高接种量和低接种量都不利于该菌株的生长,因此确定该菌株的最佳接种量为3%。

2.3.6 转速的优化 从图4f可以看出,摇床转速对XZ-2的生长影响较大。当转速在90～180 r/min之间时,随着转速的升高,该菌株的生长量逐渐升高;当转速为180 r/min时OD600最大,为0.723;当转速继续升高时,菌株发酵液的OD600值则逐渐下降,因此认为180 r/min为菌株XZ-2发酵培养的最佳转速。

图4 不同发酵条件对多粘类芽孢杆菌XZ-2生长的影响

3 讨论与结论

单因素试验是在假设不同因素间不存在相互作用的前提下,通过一次只改变一个因素而其他因素维持不变,研究不同因素对结果的影响,是试验中最常用的优化策略之一[12]。然而,大部分培养基成分复杂,仅通过单因素试验往往无法获得准确的结果,特别是在试验因素较多的情况下,需要进行较多的试验次数和试验周期才能完成各因素的逐个优化筛选[13-14]。因此,单因素试验经常被用在正交试验之前或与正交试验相结合使用。正交试验是利用一套表格,设计多因素、多指标、多因素间存在交互作用而具有随机误差的试验,并利用普通的统计分析方法来分析试验结果[15]。本文采用单因素实验设计和正交实验设计相结合的方法,对XZ-2的发酵培养基配方和发酵条件进行了优化。单因素实验结果表明XZ-2的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为蛋白胨,最佳无机盐为硫酸镁和氯化钙;结合单因素实验结果开展正交实验,结果显示该菌株的最佳培养基组分为蔗糖15 g/L,蛋白胨15 g/L,硫酸镁5 g/L,氯化钙3 g/L。同时,通过研究优化了菌株XZ-2的发酵条件:培养基初始pH值8,发酵温度30 ℃,发酵时间24 h,装液量80 mL/250 mL,接种量3%,转速180 r/min。

近年来,关于多粘类芽孢杆菌发酵条件优化的相关报道有很多,如陈小煌等研究发现：多粘类芽孢杆菌菌株B-306的最适培养基为:碳源可溶性淀粉17.5 g/L、氮源蛋白胨25.0 g/L、无机盐NaCl 1.25 g/L、Na2HPO40.5 g/L、CaCl21.0 g/L;最适发酵条件为:初始pH值7.5,培养温度30 ℃,转速170 r/min,装液量80 mL/250 mL,接种量10%[7]。金莉萍等对多粘类芽孢杆菌CF05的发酵条件进行优化,结果筛选出碳源豆粕10 g/L和鱼粉10 g/L,氮源玉米粉20 g/L,无机盐MgSO40.5 g/L和CaCl20.5 g/L为最适培养基配方,且初始pH值7.2、培养温度30 ℃、接种量2%为该菌株的最适发酵条件[16]。林茂兹等研究表明多粘类芽孢杆菌S960的最佳发酵条件是:初始pH值7.0,转速150 r/min,装液量25 mL/250 mL,接种量2%[17]。王智文等对Cp-S316菌株抗真菌活性物质的发酵培养基成分及培养条件进行了优化,发现最佳培养基配方为土豆100 g、乳糖40 g、蛋白胨15 g、硝酸钠0.5 g、硫酸镁2 g、水1 L,最佳培养条件为培养基初始pH值6.3～6.5,培养温度30 ℃,接种量2%,装液量100 mL/500 mL[18]。对比以上研究结果和本文研究结论,我们发现不同多粘类芽孢杆菌菌株的培养基配方及发酵条件之间存在差异,这可能与菌株的地理来源和采集环境相关。对此,我们应根据菌株差异选择相应的培养基成分和发酵条件,使该菌株的生长和防治效果得到最佳发挥。以后,我们还将进一步研究培养基成分及发酵条件对XZ-2发酵液抑菌活性的影响,为该菌株的开发应用提供理论依据。