胰泰复方对胰腺纤维化大鼠腺泡细胞凋亡的影响

高丽娟 刘莉 刘华生 王科军 郑南

[摘要] 目的 观察胰泰复方对胰腺纤维化大鼠腺泡细胞凋亡的影响。 方法 将60只SD雄性大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、清胰利胆颗粒组和胰泰复方高、中、低剂量组。腹腔注射13.3% L-精氨酸造模后各组给药，胰泰复方高、中、低剂量組分别给予胰泰复方22.32、11.16、5.58 g/kg，清胰利胆颗粒组给予清胰利胆颗粒2.678 g/kg，空白组、模型组均给予2 mL生理盐水。各组连续治疗30 d后取胰腺，用于TUNEL细胞凋亡检测及Caspase-3的Western blot和免疫组化检测。 结果 TUNEL细胞凋亡检测结果显示，胰泰复方各治疗组凋亡细胞面密度明显少于模型组（P < 0.05），胰泰复方中剂量组明显少于胰泰复方低剂量组（P < 0.05）。Western blot和免疫组化检测Caspase-3蛋白表达结果显示，胰泰复方高、中剂量组与模型组比较下降显著（P < 0.05），胰泰复方中剂量组比胰泰复方高剂量组下降亦显著（P < 0.05）。 结论 减少胰腺腺泡细胞凋亡可能是胰泰复方延缓胰腺纤维化的机制之一。

[关键词] 胰腺纤维化；胰泰复方；细胞凋亡；L-精氨酸

[中图分类号] R576 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（c）-0019-04

The effect of Yitai Compound on apoptosis of acinous cells in the rats with pancreatic fibrosis

GAO Lijuan1，2 LIU Li3 LIU Huasheng2 WANG Kejun4 ZHENG Nan2

1.Department of Rheumatology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Basic Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 4.Integrated Chinese and Western Medicine College， Binzhou Medical University， Shandong Province， Yantai 264003， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Yitai Compound on apoptosis of acinous cells in the rats with pancreatic fibrosis. Methods Sixty SD male rats were randomly divided into blank group， model group， Qingyi Lidan Granules group， and high， medium， low dose of Yitai Compound groups by random number table method. After creation of models by intraperitoneal injection of 13.3% L-arginine， all rats were given the treatment. The rats in high， medium， low dose of Yitai Compound groups were respectively given Yitai Compound 22.32， 11.16， 5.58 g/kg， Qingyi Lidan Granules group was given Qingyi Lidan Granules 2.678 g/kg， both blank group and model group were given 2 mL normal saline. The treatment lasted for 30 days. After treatment， the pancreas was taken for detecting the apoptosis by TUNEL and the expression of Caspase-3 by Western blot and immunohistochemmistry. Results The results of cell apoptosis by TUNEL showed that the area density of apoptosis in all Yitai Compound groups was significantly less than that of model group （P < 0.05）， which of medium dose of Yitai Compound group was less than that of low dose of Yitai Compound group （P < 0.05）. The expression of Caspase-3 by Western blot and immunohistochemmistry showed that high， medium dose of Yitai Compound groups were lower than that of model group （P < 0.05）， and medium dose of Yitai Compound group was lower than that of high dose of Yitai Compound group （P < 0.05）. Conclusion Reducing the apoptosis of acinous cells in pancreas may be one of the mechanisms for Yitai Compound delaying pancreatic fibrosis

[Key words] Pancreatic fibrosis； Yitai Compound； Cell apoptosis； L-arginine

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是指多種原因引起的胰腺组织的炎性疾病，因炎症的持续性、反复性导致胰腺腺泡不同程度的萎缩、变形，部分胰腺纤维化、钙化，最终功能损坏。该病临床表现多样，病程迁延，并发症多，一般预后不良。细胞凋亡是指机体中正常组织细胞在受到各种刺激后出现的、按照一定程序发生的自发性死亡[1]。细胞凋亡对维持机体稳态、组织分化、器官发育等有重要意义。Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必需因子，是细胞凋亡的主要执行者，亦是多种凋亡途径的共同下游效应部分。本研究前期在血清学、组织形态学方面对胰泰复方防治胰腺纤维化做了很多研究与报道，并用13.3% L-精氨酸溶液成功复制大鼠胰腺纤维化动物模型。本研究拟通过观察Caspase-3蛋白的表达变化，探讨胰泰复方在胰腺腺泡细胞凋亡方面防治CP胰腺纤维化的作用机制。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SPF级健康SD雄性大鼠，6月龄，体重（180±20）g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号：SCXK（黑）2015-003]。标准化饲养，室温20～22℃，湿度40%～70%，每日光照12 h。

1.2 药物

胰泰复方组成：茯苓15 g、人参15 g、当归15 g、炒白术15 g、柴胡15 g、桃仁10 g、红花10 g、佛手10 g、郁金10 g、甘草10 g（药物均来自黑龙江中医药大学附属第一医院草药局），加8倍量水浸泡药物4 h，煎煮1 h，滤出药液，再加6倍水，煎煮1 h，2次滤液合并，浓缩成浓度为1∶1的水煎剂。清胰利胆颗粒由长春银诺克药业有限公司提供（批号：20160951）。

1.3 分组与给药

按随机数字表法将60只大鼠分为空白组、模型组、清胰利胆颗粒组、胰泰复方低剂量组、胰泰复方中剂量组、胰泰复方高剂量组。除空白组外，其余各组大鼠在左下腹腔注射13.3% L-精氨酸3次，3 d给药1次，每次分2次给药，按大鼠2 g/kg计算剂量，空白组用2 mL生理盐水（造模标准参照文献[11]）。自第11天开始灌胃，胰泰复方中剂量组为11.16 g/kg（按正常成人与大鼠给药剂量系数折算）；胰泰复方低剂量组为5.58 g/kg（胰泰复方中剂量组剂量的1/2倍）；胰泰复方高剂量组为22.32 g/kg（胰泰复方中剂量组剂量的2倍）；清胰利胆颗粒组为2.678 g/kg（正常成人30 g/d）；空白组、模型组用2 mL生理盐水，每日1次，连续30 d。

1.4 标本采集

大鼠断颈处死，开腹用眼科剪取胰腺分两部分：一部分锡纸包裹后立即置于液氮，再转至-80℃冰箱，用于Western blot检测；一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于原位末端标记法（TUNEL）细胞凋亡检测及免疫组化检测。

1.5 统计学方法

用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原位细胞凋亡检测结果

凋亡细胞主要表达于细胞核，TUNEL检测在显微镜下观察凋亡细胞为棕色，正常细胞为蓝紫色。各组原位凋亡细胞TUNEL检测结果显示，空白组为正常蓝紫色细胞，模型组可见最多的棕色凋亡细胞，清胰利胆颗粒组可见较多棕色凋亡细胞，胰泰复方高剂量组可见正常蓝紫色细胞及少量棕色凋亡细胞，胰泰复方中剂量组亦可见正常蓝紫色细胞及少量棕色凋亡细胞，胰泰复方低剂量组可见较多棕色凋亡细胞（图1，封四）。

原位细胞凋亡检测结果显示，模型组胰腺细胞凋亡细胞面密度明显高于空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）；各治疗组胰腺细胞凋亡细胞面密度明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；胰泰复方中剂量组胰腺细胞凋亡细胞面密度明显低于胰泰复方低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 免疫组织化学检测胰腺Caspase-3蛋白的表达

显微镜下细胞浆或细胞核中Caspase-3有表达者为棕黄色颗粒，无棕黄色颗粒则为无表达。Caspase-3抗原阳性细胞呈棕黄色，胞浆胞核均有表达，但以胞浆表达为主。各组胰腺Caspase-3蛋白表达免疫组化检测结果显示，空白组中未见棕黄色颗粒，模型组细胞胞浆胞核中均可见较多棕黄色颗粒，清胰利胆颗粒组也可见较多棕黄色颗粒，胰泰复方高剂量组棕黄色颗粒较少，胰泰复方中剂量组棕黄色颗粒也较少，胰泰复方低剂量组可见较多棕黄色颗粒（图2，封四）。

免疫组化检测胰腺Caspase-3蛋白表达统计结果显示，模型组Caspase-3蛋白表达明显高于空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）；胰泰复方高、中剂量组Caspase-3蛋白表达明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；胰泰复方中剂量组Caspase-3蛋白表达低于胰泰复方高、低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 Western-blot检测胰腺Caspase-3蛋白的表达

Western blot检测结果显示，模型组Caspase-3蛋白表达明显上调，高于空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）。治疗后，各治疗组Caspase-3蛋白表达明显下降，显著低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。胰泰复方中剂量组与胰泰复方高、低剂量组比较显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3、图3。

1.空白组；2.模型组；3.清胰利胆颗粒组；4.胰泰复方高剂量组；5.胰泰复方中剂量组；6.胰泰复方低剂量组

图3 各组胰腺组织Caspase-3蛋白表达情况

3 讨论

细胞凋亡是机体用来去除异常生长细胞和老化细胞的一种重要机制，是维持细胞群体动态平衡的重要因素[2-5]，然而过多或过少的细胞凋亡都会引起疾病的发生。细胞凋亡可由多种因素诱导（如病毒感染、药物、缺氧等），是一个信号依赖的过程，其在形态学上表现为核染色质凝缩、胞质浓缩、DNA大规模断片化、细胞膜内陷、发泡形成凋亡小体[6-9]。

Caspase亦称为死亡蛋白酶或细胞介素IB转化酶（ICE），是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶[10-11]。Caspase介导的细胞凋亡的关键点的汇集是在Caspase-3上[12-14]。Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必需因子，是细胞凋亡的主要执行者，亦是多种凋亡途径的共同下游效应部分。Caspase-3以酶原的形式合成、存储，只有在细胞凋亡的级联反应中才被活化[15]。Caspase-3的活化是细胞凋亡的早期反应，在凋亡过程中起着重要作用。活化的Caspase-3可以破坏细胞内多种蛋白酶复合体，激活核内核酸酶，造成DNA损伤，从而导致细胞凋亡[16]。

胰腺外分泌腺泡萎缩，继而由增生的纤维组织代之，是CP胰腺病理组织学改变的最主要表现，而胰腺腺泡的减少是胰腺纤维化的前提[17-20]。胰腺腺泡减少有两种方式：坏死和凋亡[21]。人、鼠CP组织中均存在胰腺腺泡细胞凋亡现象[22]。因此，诱导胰腺腺泡细胞凋亡而导致胰腺实质萎缩，是CP胰腺纤维化形成的主要机制之一。目前已知的两条经典的凋亡途径是线粒体损伤途径（内源性途径）和死亡受体活化途径（外源性途径）[23-25]。

本研究通过TUNEL检测发现模型组凋亡细胞面密度显著高于空白组，说明CP胰腺中确实存在腺泡细胞的凋亡；同时免疫组织化学法及Western blot法检测显示模型组Caspase-3蛋白表达明显上调，再次证实CP时大鼠体内已启动细胞凋亡。治疗后胰泰复方中剂量组显著优于模型组，同时该组也下调了Caspase-3蛋白表达，提示胰泰复方可阻止Caspase-3的活化，从而阻止细胞凋亡，抑制CP胰腺纤维化的进程，这也说明胰泰复方延缓胰腺纖维化的机制可能是与减少胰腺腺泡细胞凋亡有关。此外，本研究将胰泰复方分为高、中、低三组，结果显示中剂量即按正常成人与大鼠给药剂量系数折算的剂量疗效最佳。

CP的主要病机是本虚标实，本虚即脾虚，标实即气滞血瘀。脾虚气血生化无源，而致肝失濡养，肝疏泄不利，气机郁滞则血瘀。本研究以健脾疏肝活血法为原则，在四君子汤和复元活血汤基础上化裁而成胰泰复方。方中白术、人参、茯苓为君，健脾益气；桃仁、柴胡、当归为臣药，疏肝活血止痛；佐以郁金、红花、佛手理气活血；使以炙甘草补气、调和诸药。诸药合用，行健脾益气、行气活血之效。

本研究显示，通过抑制胰腺腺泡细胞凋亡可能是胰泰复方防治CP胰腺纤维化的作用机制之一。

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（收稿日期：2018-03-08 本文编辑：张瑜杰）