血浆miRNA—21和miRNA—142—5p表达水平对肾细胞癌的诊断价值评价

李乾 姜福金 温儒民 王文天

[摘要] 目的 探討血浆miRNA-21和miRNA-142-5p表达水平在肾细胞癌临床诊断中的价值。 方法 收集淮安市第二人民医院2015年7月～2017年10月的肾细胞癌患者和良性肾病患者血液标本，分别为55例和49例。应用实时荧光定量PCR法检测肾细胞癌患者和良性肾病患者血浆中miRNA-21和miRNA-142-5p的表达，并分析血浆miRNA-21和miRNA-142-5p表达量与肿瘤患者临床病理特征的相关性。构建受试者工作特征（ROC）曲线，评估这两个血浆miRNAs对于肾细胞癌的诊断效能。 结果 肾细胞癌患者血浆中miRNA-21和miRNA-142-5p的表达水平均明显高于良性肾疾病患者（P < 0.01）。血浆miRNA-21的表达水平与肾细胞癌的临床分期显著相关（P < 0.05），而血浆miRNA-142-5p的表达与肾细胞癌患者的临床病理特征无明显相关性（P > 0.05）。55例肾细胞癌患者血浆中miRNA-21、miRNA-142-5p表达量无明显相关性（P > 0.05）。血浆miRNA-21和miRNA-142-5p的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.826（95%CI：0.794～0.912）和0.805（95%CI：0.744～0.919）。血浆miRNA-21诊断肾细胞癌的敏感性和特异性分别为81.8%和83.7%，血浆miRNA-142-5p诊断肾细胞癌的敏感性和特异性分别为80.0%和77.6%。而两种miRNAs联合检测，诊断肾细胞癌的敏感性提高至87.3%，但特异性略有下降，为75.5%。 结论 血浆中miRNA-21和miRNA-142-5p表达水平很有可能成为肾细胞癌诊断的潜在生物标志物。

[关键词] 荧光定量PCR；肾细胞癌；miRNA-21；miRNA-142-5p；诊断

[中图分类号] R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（c）-0004-05

Evaluation of diagnosis value of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p in renal cell carcinoma

LI Qian1 JIANG Fujin2 WEN Rumin1 WANG Wentian3

1.Clinical College， Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China； 2.Depatrment of Urinary Surgery， the Second People′s Hospital of Huai′an， Jiangsu Procince， Huai′an 212001， China； 3.The State Key Laboratory of Experimental Hematology， Institute of Hematology & Blood Disease Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences， Tianjin 300020， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical values of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p expression levels in the diagnosis of renal cell carcinoma （RCC）. Methods Blood samples of patients with RCC and bebign renal disease from July 2015 to October 2017 in the Second People′s Hospital of Huai′an were collected， there were 55 cases and 49 cases respectively. The expression levels of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p were determined by fluorescence quantitative PCR in these patients. The correlations between the two miRNAs levels in plasma and clinicopathological characteristics of patients with RCC were analyzed. The diagnostic performance of each miRNA to distinguish RCC from benign renal disease was evaluated by the receiver operating characteristic （ROC） curve analysis. Results The levels of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p in RCC patients were higher than those in benign renal disease （P < 0.01）. There was no significant correlation between plasma miRNA-142-5p levels and clinicopathological characteristics of RCC patients （P > 0.05）， whereas the expression levels of plasma miRNA-21 was correlated with clinical stages （P < 0.05）. There was no significant correlation between the expression of miRNA-21 and miRNA-142-5p in the plasma of 55 patients with RCC （P > 0.05）. The area under ROC curve of the two miRNAs were 0.826 （95%CI：0.794-0.912） and 0.805 （95%CI：0.744-0.919）. The sensitivity and specificity were 81.8% and 83.7% for miRNA-21， and 80.0% and 77.6% for miRNA-142-5p， respectively， for diagnosing RCC. And the sensitivity was increased to 87.3% with miRNA-21 in combination with miRNA-142-5p， despite slightly decreased specificity which was 75.5%. Conclusion These findings demonstrated that plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p may serve as a promising biomarker in the diagnosis of RCC.

[Key words] Fluorescent quantitative RT-PCR； Renal cell carcinoma； miRNA-21； miRNA-142-5p； Diagnosis

肾细胞癌是肾脏最常见的恶性肿瘤。研究表明，肾细胞癌发病率每年进行性递增[1]。肾细胞癌根治术仍是当前主要手段，但对于肾细胞癌晚期疗效不佳，30%～50%的肾细胞癌患者因缺乏早期临床表现而错过最佳手术时机。如何提高肾细胞癌的早期检出率仍是恶性肿瘤研究的前沿，目前暂无有临床价值的肿瘤标志物。因此，寻找肾细胞癌的筛查及诊断的生物学标志物至关重要。

研究发现miRNA可通过绑定靶mRNA的3′非编码区，导致信使RNA降解或转录抑制[2]。它在肿瘤中存在突变[3]，进而调控肿瘤的发生、发展。有文献报道miRNA-21在肾细胞癌组织和外周血中表达均上调[4-5]，miRNA-142-5p在肾细胞癌组织中呈高表达[6]。关于血浆miRNA-21及miRNA-142-5p是否可联合作为肾细胞癌诊断的生物标志物值得研究。因此，本研究应用荧光定量PCR法检测肾细胞癌患者及良性肾疾病患者血浆miRNA-21和miRNA-142-5p的相对表达量，探讨它们用于肾细胞癌诊断的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究已通过了江苏省淮安市医学伦理委员会批准，并与研究对象签署了知情同意书。选取江苏省淮安市第二人民医院（以下简称“我院”）2015年7月～2017年10月的肾细胞癌患者55例，均为未接受过任何治疗的初诊患者，肾脏转移瘤除外，所有入组RCC患者均已明确病理诊断。其中男41例，女14例；年龄35～81岁；有吸烟史40例，无吸烟史15例；组织学类型：透明细胞癌39例，乳头状癌7例，嫌色细胞癌6例，未分类癌3例；根据国际抗癌联盟（UICC）2002年制订的TNM分期标准：Ⅰ期+Ⅱ期25例、Ⅲ期+Ⅳ期30例；病理学检查报告仅31例有肿瘤分化程度分级表述，其中低分化13例，中高分化18例。另选择同期入住我院的良性肾病患者49例作为对照组，包括肾结石21例，肾囊肿20例，肾炎5例，肾外伤2例，肾错构瘤1例（检查均排除恶性肿瘤可能）；男30例，女19例；年龄22～65岁。并抽取20例健康志愿者的血浆标本作为研究对象血浆miRNA时的校对值（其中男12例，女8例，年龄26～40岁）。

1.2 研究方法

1.2.1 标本的收集 所有研究对象均用抗凝管抽取外周静脉血6 mL，2 h内于实验室低速离心机离心10 min，离心半径100 mm，转速2500 r/min，提取血浆600 μL，用1.5 mL无RNA酶的EP管分装，冻存于-80℃超低温冰箱。

1.2.2 总RNA的提取 总RNA的提取按照美国ABI公司的mirVana PARIS試剂盒的说明书操作，所有过程在超净工作台上完成，提取的RNA最终用DEPC水溶解，其浓度及纯度使用U-2800紫外分光光度仪测定，置-20℃冰箱备用。

1.2.3 逆转录合成cDNA 使用日本Takara公司的逆转录试剂盒，采用茎-环法，采用25 μL反应体系：9 μL的RNA模板加入RT引物工作液2 μL混匀后，在PCR仪加热至70℃ 10 min，冰育2 min。再依次加入5×PrimeScript Buffer 5 μL、PrimeScript RT Enzyme MixI 1 μL以及DEPC水8 μL，瞬时离心，进行RT反应：PCR仪42℃ 60 min，70℃ 10 min。

1.2.4 实时荧光定量PCR 选用日本Takara公司的实时荧光定量PCR试剂盒，按照广州锐博公司的miRNA茎-环结构引物的说明书进行操作：以U6作为内参基因，每份血浆标本均扩增U6、miRNA-21、miRNA-142-5p。采用20 μL反应体系：包括cDNA 2 μL，SYBRGree Mix 9 μL，Bulge-loopTM miRNA Forward Primer（5 μm）0.8 μL，Bulge-loopTM miRNA Reverse Primer（5 μm）0.8 μL，Rox Reference DyeⅡ0.4 μL，RNase-free水7 μL，瞬时离心后，放入PCR仪内，温度设定为95℃ 20 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40个循环，每份标本重复做3次。根据荧光定量PCR仪检测所得的Ct值，采用2-△△Ct的方法计算血浆miRNA-21和miRNA-223的相对表达量，△△Ct实验组△Ct-校正值△Ct=（实验组目的基因Ct-U6Ct）-（对照组目的基因Ct-U6Ct）。实验组包括肾细胞癌组和良性肾病组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，所有数据呈非正态分布，故用中位数M，四分位数间距Q（P25，P75）表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验；相关性分析采用典型相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。并建立ROC曲线，根据AUC评估血浆miRNA-21和miRNA-142-5p用于诊断肾细胞癌的效能，根据约登指数最大时所对应的点，在ROC曲线上分别找出这两个miRNAs诊断肾细胞癌的临界值，进一步计算这两个miRNAs用于诊断肾细胞癌的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性。

2 结果

2.1 肾细胞癌患者与良性肾病患者血浆中miRNA-21和miRNA-142-5p的表达水平

肾细胞癌组血浆中miRNA-21和miRNA-142-5p的表达水平均高于良性肾疾病组（P < 0.01）。见表1。

2.2 肾细胞癌患者血浆miRNA-21和miRNA-142-5p水平与临床病理学特征的关系

肾细胞癌患者血浆miRNA-21的表达水平与患者的临床分期相关，差异有统计学意义（P < 0.05）。而血浆miRNA-142-5p的表达水平与患者的临床病理学特征均未见明显相关性（P > 0.05）。见表2。

2.3 miRNA-21、miRNA-142-5p的表达水平分别用于诊断肾细胞癌的ROC曲线

根据ROC曲线分析结果（图1），miRNA-21诊断肾细胞癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.826（标准误0.041，95%CI：0.794～0.912）。取5.025为诊断肾细胞癌的临界值，其相应的敏感度和特异度分别为81.8%和83.7%。血浆miRNA-142-5p诊断肾细胞癌的AUC为0.805（标准误0.051，95%CI：0.744～0.919）（图2）。根据ROC曲线图取miRNA-142-5p用于诊断肾细胞癌的临界值为8.375，其相应的敏感度和特异度分别为80.0%和77.6%，将miRNA-21、miRNA-142-5p二者联合实验，分别计算敏感度和特异度，诊断肾细胞癌的敏感性有所提高，为87.3%，但特异性略有下降，为75.5%。见表3。

2.4 肾细胞癌患者血浆miRNA-21、miRNA-142-5p的表达量的相关性分析

55例肾细胞癌患者血浆中miRNA-21、miRNA-142-5p表达量无明显相关性（r = 0.184，P = 0.215）。

3 讨论

目前肾细胞癌的治疗以手术为主，肾细胞癌早期行根治性切除术大多可取到良好效果。但对于晚期或已发生转移的患者，绝大多数已错过手术时机。所以肿瘤的早期发现与治疗是降低其死亡率的关键，但多数肿瘤缺乏高敏感性和高特异性的标志物[7]。miRNA的发现及其研究成果拓宽了对癌症发生机制认知的视野。在肾细胞癌组织中，多个miRNA异常表达与肿瘤发生、发展等相关性研究已被报道。研究者发现miRNA-381、miRNA-30a、miRNA-199a等在肾细胞癌组织中呈低表达[8-11]，而miRNA-378、miRNA-30b、miRNA-106a、miRNA-222等在肾细胞癌组织及血液中呈高表达[12-15]。由于循环miRNA免于被RNA酶降解且在外周血中高度稳定，且具有肿瘤相关性与组织特异性等特点[16]，故它们已被视为癌症监测中新的潜在生物标志物[17]。

本实验通过检测肾细胞癌患者及良性肾脏疾病血浆中miRNA-21及miRNA-142-5p相对表达量的分析得出实验组miRNA-21及miRNA-142-5p表达水平均高于对照组（P < 0.01），应用受试者ROC曲线分析血浆中miRNA-21、miRNA-142-5p在肾细胞癌诊断中的价值，miRNA-21的AUC为0.826，灵敏度为81.8%，特异度为83.7%；miRNA-142-5p的AUC為0.805，灵敏度为80.0%，特异度为77.6%。因此，推测miRNA-21、miRNA-142-5p可以成为肾细胞癌的潜在生物标志物。本研究结果与目前一些研究的结果相符。如有研究提示，肾细胞癌患者血清中miRNA-21呈现高表达，ROC曲线下面积0.865（95%CI：0.766～0.965），根据ROC曲线分析结果已符合临床应用价值，是肾细胞癌可选的诊断标志物[18]。段倞彦等[19]研究证实miRNA-21在肾细胞癌组织中呈高表达，其表达水平随着细胞侵袭力的增高而升高。尽管近年来关于miRNA142-5p与肾细胞癌的相关性研究较少，赵爽等[6]研究miRNA-142-5p在肾细胞癌组织中的表达显著高于癌旁组织，证明其与肾细胞癌的发生与进展有关。Liu等[20]报道了miRNA-142-5p通过靶向BTG3基因刺激肾细胞癌细胞的生长和转移。

目前关于不同的miRNAs在同一肿瘤发生过程中的相互作用关系（协同或拮抗作用）的研究尚少。本研究就55例肾细胞癌患者血浆中的miRNA-21、miRNA142-5p之间的关系应用相关性分析，得出miRNA-21及miRNA142-5p在肾细胞癌的发生发展中是两个独立因素，彼此无相关性。由于不同个体及肿瘤本身之间miRNAs的表达差异、标本的采集、保存方式及实验研究方法等原因不同，实验结果可能不同，本试验由于样本数量较少，研究结果还需要通过进一步扩大样本量以及进行多中心的临床试验来验证。

综上所述，肾细胞癌血浆miRNA-21、miRNA-142-5p的表达量较良性肾脏疾病患者呈现高表达，提示二者可能起到了类似癌基因的作用，有望成为肾细胞癌诊断的有临床价值的微创生物标志物。虽然肾细胞癌的确诊依赖于病理组织学证据，但高敏感和高特异的血液肿瘤标志物阳性高度提示肾细胞癌的可能性，可为进一步检查以获得病理组织学证据提供预警。

[参考文献]

[1] 马建辉.肾癌的外科诊治现状[J].中华泌尿外科杂志，2003，24（8）：65-68.

[2] Bartel DP. MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function [J]. Cell，2004，116（2）：281-297.

[3] Calin GA，Croce CM. MicroRNA and chromosomal abnormalities in cancer cells [J]. Oncogene，2006，25：6202-6210.

[4] 池泽湃，李贤新，任瑞，等.MicroRNA-21在肾细胞癌中高表达的研究[J].中华临床医师杂志，2012，6（1）：30-34.

[5] 杨益，阿不都·热扎克，木拉提·热夏提，等.肾癌患者手术前后血清miRNA-21差异表达及意义[J].海南医学，2015，26（7）：948-951.

[6] 赵爽，王海峰，刘凌琪，等. miRNA-142-5p在肾细胞癌中高表达的研究[J].山东医药，2008，48（41）：12-14.

[7] Rifai N，Gillene MA. Protein biomarker discovery and validation：the long and uncertain path to clinical utility [J]. Nal Biotechnol，2006，24（8）：971-983.

[8] 陈兵海，刘斌.MiRNA-381抑制肾癌侵袭能力及其分子机制[J].中南大学学报，2015，40（10）：1053-1059.

[9] 秦丹丹，仁野平.miRNA-30a在肾细胞癌中的表达及作用[J].中国肿瘤临床，2015，42（13）：663-667.

[10] 方慧云，陈敬国.miRNA-199a对肾癌细胞系生物学性状的影响[J].实用医技杂志，2016，23（6）：596-598.

[11] Tsukigi M，Bilim V，Yuuki K，et al. Re-expression of miR-199a suppresses renal cancer proliferation and survival by targeting GSK-3beta [J]. Cancer Lett，2012，315（2）：189-197.

[12] 杨益，阿不都·热扎克，木拉提·热夏提，等.肾癌患者血清miRNA-378的表达及其临床意义[J].临床误诊误治，2015，28（3）：93-96.

[13] 全晶，潘翔，金露，等.miRNA-30b在肾癌中的表达和临床意义[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志，2016，8（1）：27-31.

[14] 张欢，张丽，安恒庆.肾细胞癌患者血清中miRNA106a的表达及其临床意义[J].新疆医科大学学报，2015，38（9）：1151-1154.

[15] 倪晓辰，赵志红，马永良，等. miR-222通过下调DDIT4抑制肾癌细胞自噬[J].中国癌症杂志，2015，25（3）：161-166.

[16] Cho WC. OncomiRs：the discovery and progrees of microRNAs in cancers [J]. Mol caner，2007，6：60-63.

[17] Heegaard NH，Schetter AJ，Welsh JA，et al. Circulating micro-RNA expression profiles in early stage nonsmall cell lung cancer [J]. Int J Cancer，2012，130（6）：1378-1386.

[18] 管金，哈木拉提·吐送，王玉杰，等.肾癌患者血清微小RNA-21手术前后表达变化及临床意义分析[J].中华肿瘤防治杂志，2016，23（7）：441-445.

[19] 段倞彦，孙志刚，李先乘，等.肾透明细胞癌中microRNA-21和PDCD4的表達和生物学意义[J].临床军医杂志，2015，43（11）：1143-1146.

[20] Liu L，Liu S，Duan Q，et al. MicroRNA-142-5p promotes cell growth and migration inrenal cell carcinoma by targeting BTG3 [J]. Ame Jou Tra Res，2017，9（5）：2394.

（收稿日期：2018-02-08 本文编辑：李岳泽）