OEPR法构建含不同破伤风毒素T细胞表位的CPB表达质粒及其产物的初步鉴定

董令赢 ， 彭小兵 ， 彭国瑞 , 李旭妮 , 蒋玉文

(中国兽医药品监察所 ， 北京海淀100081)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又名魏氏梭菌，为革兰阳性厌氧菌，在自然界分布非常广泛，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人类的食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。产气荚膜梭菌可产生至少 18 种毒素，且多数具有致死性，根据其所产生的4种主要外毒素的基因型不同，可将其分为 A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β) 、D(α、ε)及 E(α、ι)5个型[1]。β毒素是主要由B型和C型菌株产生的坏死、致死性毒素，可引起人和家畜的坏死性肠炎和肠毒血症，同时，β毒素也是一种神经性毒素，能使家畜出现痉挛、抽搐、角弓反张等症状，会对人体健康和畜牧业的发展产生严重的影响[2]。疫苗接种是目前防控产气荚膜梭菌的主要手段。传统上，培养 B、C 型产气荚膜梭菌经甲醛灭活后制备疫苗，然而，近年来，该类产品的检验合格率不高已对疫苗的质量产生了重要影响。据报道，对我国2006年至2014年羊三联四防类疫苗的效力检验结果进行统计，结果以血清中和法检验为不符合规定的产品共有33批，其中C型产气荚膜梭菌组分不符合规定的占21批(63.6)。由此可见，C型产气荚膜梭菌组分血清抗体效价不高是导致该类疫苗不符合规定的主要因素[3]，因此，研发新型安全有效的疫苗已成为当前亟待解决的问题。

随着分子生物学的快速发展，基因工程亚单位疫苗，因其具有安全性高、成本低等优点，已逐渐被广泛应用。但是某些基因工程亚单位疫苗的免疫原性较弱，不能被抗原提呈细胞有效识别、提呈，这是限制亚单位疫苗开发和应用的一个亟待解决的问题[4]。破伤风毒素T 细胞表位属于外源性通用 Th 细胞表位，能泛特异性地结合MHCⅡ类分子，将其插入多肽抗原或半抗原中，能有效提高抗原的免疫原性[5]。据报道，可直接将多个T细胞表位相连得到串联的多肽表位，各表位之间以柔性linker连接以防止新的抗原表位形成。此连接法可以有效地增强抗原多肽表位的免疫原性[6]。因此，本研究将破伤风毒素辅助性T细胞表位P2 、P21-P30-P2 、P32-P23-P21-P30-P2引入蛋白前，用OEPR法分别构建到pCold pros2和pET22(+)载体中，将重组质粒分别转化大肠杆菌表达重组蛋白，SDS-PAGE分析蛋白的表达形式，Western Blotting检测其免疫原性，为后续评价破伤风毒素辅助T细胞表位对β毒素免疫原性的影响及亚单位疫苗的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种 pCold ProS2、pET22b(+)质粒由本实验室保存；Trans1-T1 、BL21(DE3)感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；Rosetta(DE3)感受态细胞，购自天根生化科技(北京)有限公司；pEZ-clone为含P32-P23-P21-P30-P2-cpb全基因序列的重组质粒由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成(P2、P21、P23、P30、P32均为破伤风毒素辅助性T细胞表位，其氨基酸序列分别为：P2 QYIKANSKFIGITE；P21 IREDNNITLKLDRCNN；P23 VSIDKFRIFCKANPK；P30 FNNFTVSFWLRVPKVVSASHLE；P32 LKFIIKRYTPNNEIDS。cpb为密码子优化后的β毒素基因)。

1.2 培养基 LB琼脂、LB肉汤，均购自北京中海生物科技有限公司；自诱导培养基参照文献[7]配制；氨苄青霉素，购自生工生物工程(上海)技术服务有限公司。

1.3 主要试剂 质粒小量提取试剂盒、DMT酶，购自北京全式金生物技术有限公司；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix、2×A9 LongHiFi PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自北京艾德莱生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DAB显色试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；BugBuster Protein Extraction Reagent，购自Novagen公司；核糖核酸酶A、溶菌酶，购自生工生物工程(上海)技术服务有限公司。

1.4 试验用动物 CD-1(ICR)小鼠，体重16～18 g，SPF级；购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.5 方法

1.5.1 引物设计与合成 依据OEPR法原理，利用Primer 5.0软件进行引物设计，见表1、2。

表1 用于构建含不同破伤风毒素T细胞表位的pCold重组质粒的引物

表2 用于构建含不同破伤风毒素T细胞表位的pET22b重组质粒的引物

1.5.2 含T细胞表位的β毒素目的片段的扩增 用于构建到pCold proS2载体上目的片段的扩增体系：模板(pEZ-clone质粒)1 μL，上游引物(F-C1或F-C2或F-C3或F-C4) 1 μL，下游引物(R-C)1 μL， 2×A8 Master Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃热变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸2 min。

用于构建到pET22b载体上目的片段的扩增体系：模板(pEZ-clone质粒)1 μL，上游引物(F-E1或F-E2或F-E3或F-E4) 1 μL，下游引物(R-E)1 μL， 2× A8 Master Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃热变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

以上两组扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增得到的目的片段用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化。

1.5.3 pCold-CPB系列质粒和pET22b-CPB系列质粒的构建 pCold-CPB系列质粒构建体系：模板(pCold空质粒)0.3 μL，用于pCold proS2载体构建的目的片段 各2.5 μL，2×A9 Master Mix 12.5 μL，R-pCold 0.5 μL，ddH2O 9.7 μL。反应条件：98 ℃预变性3 min，95 ℃热变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸180 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

pET22b-CPB系列质粒构建体系：模板(pET22b空质粒)0.2 μL，用于pET22b(+)载体构建的目的片段 各11.8 μL，2×A9 Master Mix 12.5 μL，R-pET22b 0.5 μL。反应条件：98 ℃预变性3 min，95 ℃热变性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸240 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。

以上两组构建产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5.4 转化 向pCold-CPB及pET22b-CPB系列质粒构建产物，加入DMT酶于37 ℃过夜消化，转化至Trans1-T1感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的平板。

1.5.5 质粒的测序鉴定 取单菌落培养后提取质粒，以载体上游通用引物(pCold ProS2-F2 primer或T7 promoter primer)及cpb基因的反向引物(R-C或R-E)进行PCR鉴定，将鉴定结果阳性的质粒送交中美泰和生物(北京)有限公司测序鉴定。

1.5.6 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 将鉴定阳性的重组质粒pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB及空质粒pCold转化BL21(DE)感受态细胞；将鉴定阳性的重组质粒pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB及空质粒pET22b转化Rosetta(DE3)感受态细胞。对以上重组菌进行诱导表达。分别挑取阳性重组菌和空载体对照菌的单菌落，于自诱导培养基中，25 ℃诱导28 h。SDS-PAGE鉴定重组蛋白是否表达，并分析其表达形式。

1.5.7 Western Blot检测 蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF硝酸纤维素膜上，以C型产气荚膜梭菌兔抗血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG抗体为二抗，进行Western Blot 检测。

1.5.8 毒性试验 将诱导表达的各重组菌液，0.2 mL/只，腹腔注射16～18 g ICR小鼠，每组2只。同时设pCold proS2在E.coliBL21(DE3)、pET22b(+)在Rosetta(DE3)诱导后菌液为对照组，观察72 h，记录死亡情况。

2 结果

2.1 含T细胞表位的β毒素基因片段扩增 以pEZ-clone质粒为模板扩增出含有相应载体同源臂的cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-cpb、P32-P23-P21-P30-P2-cpb片段，大小分为991 bp、1 033 bp、1 143 bp、1 252 bp与预期大小一致(见图1和图2)。

图1 用于pCold载体的CPB片段的扩增结果

M: DNA MarkerⅡ； 1、2、3、4：cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-CPB、P32-P23-P21-P30-P2-cpb的PCR产物

图2 用于pET22b载体的CPB片段的扩增结果

M: DNA MarkerⅡ； 1、2、3、4：cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-CPB、P32-P23-P21-P30-P2-cpb的PCR产物

2.2 构建pCold-CPB和pET22b-CPB系列质粒 采用OEPR法分别以pCold和pET22b空质粒为模板，利用R-pCold或R-pET22b引物，将含不同T细胞表位的CPB片段克隆至pCold及pET22b载体上，获得重组表达质粒。pCold系列质粒大小约6 000 bp，pET22b系列质粒大小约6 400 bp，核酸电泳结果如图3和图4，与预期大小一致。

2.3 质粒测序结果 分析测序峰图可见目的片段cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-cpb、P32-P23-P21-P30-P2-cpb分别成功构建至pCold及pET22b载体，中插彩版图5至图12为重组质粒上目的片段与载体连接处峰图测序结果，表明使用OEPR法成功构建以上8个重组质粒。8个重组质粒的测序结果与预期序列的同源性均为100%，并且阅读框均未发生移码。

图3 pCold-CPB系列质粒构建结果

M:DL-15 000 DNA Marker； 1、2、3、4：pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB

图4 pET22b-CPB系列质粒构建结果

M:DL-15 000 DNA Marker； 1、2、3、4：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB

2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 重组菌经BugBuster蛋白抽提试剂、核糖核酸酶A及溶菌酶破碎处理后，进行SDS-PAGE分析。pCold-CPB(60 kDa)、pCold-P2-CPB(62 kDa)、pCold-P21-P30-P2-CPB(66 kDa)、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB(70 kDa)重组蛋白在BL21(DE3)中成功表达；pET22b-CPB(40 kDa)、pET22b-P2-CPB(41 kDa)、pET22b-P21-P30-P2-CPB(46 kDa)、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB(50 kDa)重组蛋白在Rosetta(DE3)中成功表达，蛋白大小与预期一致(图13和图14)，在pET22b载体中，重组蛋白的表达形式均为包涵体；在pCold载体中，重组蛋白的大部分以包涵体形式表达，pCold-CPB、pCold-P2-CPB部分以可溶形式表达。

图13 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

M:蛋白分子量Marker； 1：BL21(DE3)(pCold pro S2)未诱导； 2：BL21(DE3)(pCold pro S2)诱导后； 3、5、7、9：pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB诱导后菌体裂解上清； 4、6、8、10：pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB诱导后菌体裂解沉淀

图14 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

M：蛋白分子量Marker； 1、3、5、7：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB诱导后菌体裂解上清； 2、4、6、8：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB诱导后菌体裂解沉淀

2.5 重组蛋白的Western Blot分析 免疫印迹结果表明，pET22b系列质粒、pCold系列质粒分别在预期大小出现明显的条带(图15和图16)，说明重组蛋白具有良好的反应原性。

2.6 毒性试验 在72 h内，对照组均未死亡。每组注射了重组菌液的小鼠均2/2死亡，表明以上8种蛋白均具备毒性。

图15 pET22b-CPB免疫印迹结果

M:蛋白分子量Marker； 1、2、3、4：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB

图16 pCold-CPB免疫印迹结果

M:蛋白分子量Marker； 1、2、3、4：pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-CPB； 5：pCold proS2 BL21(DE3)未诱导； 6：pCold proS2 BL21(DE3)诱导后

3 讨论

目前，构建重组质粒的方法主要有3种：(1)双酶切法，将目的片段、载体分别双酶切后，连接，这种方法不仅费时费力，而且成功率很低；(2)无缝克隆法，此法是利用同源重组酶及同源重组臂将DNA片段克隆至载体，现常用此法，但是此法对含二级结构及其他复杂结构的质粒构建较困难；(3)以PCR延伸为基础的克隆方法，如RF(Restriction-free) cloning、EMP(Exponential Megapriming PCR)等，RF cloning法可直接、有效的将目的片段连接到靶载体上，但是当目的片段大于1 kb时，此方法克隆的效率会大大降低[8]；EMP法引入了一条反向引物，这提高了连接的效率，但是该法第二轮PCR后产物的磷酸化和连接，增加了劳动和经济成本[9]。笔者多次采用无缝克隆法构建pCold系列质粒，始终无法成功，经分析pro S2中含有两个几乎完全重复的序列，进而可能形成高级结构导致无缝克隆法构建失败。故，本实验选用OEPR法构建重组质粒，OEPR法是一种不依赖于T4连接酶，不受载体和目的片段酶切位点限制的克隆方法，该法是基于重叠延伸PCR及体内重组的一种有效的大DNA片段克隆的方法。利用该克隆技术，可以很容易地将1～6 kb的长片段或同时将2～4个片段组装到目标载体上。与传统的克隆方法相比，OEPR克隆法对插入长片段和组装多个片段是更有效和更经济的方法[10]。本试验选用同源臂的长度为24 bp，Tm值为69 ℃，均成功高效地构建出8个重组质粒。

本研究中使用的P32、P23、P21、P30、P2均来源于破伤风毒素氨，均为通用CD4+辅助性T细胞表位。将其加入弱免疫原性的多肽抗原或半抗原后, 可以泛特异性地结合MHC Ⅱ类分子，进而使B细胞活化、增殖，进而分泌高水平抗体，从而有效提高多肽抗原或半抗原的免疫原性[11]。利用辅助性T细胞表位增强亚单位疫苗免疫原性的研究有很多。如2006年，Nina在恶性疟原虫B细胞表位抗原肽上引入包括破伤风毒素的T细胞表位P2等4种不同的T细胞表位，将其免疫C57BL/6和BALB/c小鼠，发现T细胞表位不仅能增强小鼠的体液免疫，还能提高其细胞免疫水平[12]。2013年，李国新合成了含有猪瘟病毒 E2 蛋白线性中和表位的短肽B，合成了含有通用型辅助性T细胞表位的短肽 Th-B。将上述2种合成肽与弗氏佐剂混合乳化后，免疫兔子，并用猪瘟弱毒对免疫兔子进行攻击，比较抗原肽的免疫保护效果。结果显示，通用型辅助性 T 细胞表位增强了短肽抗原的免疫原性[13]。2016年，闻晓波构建了猪轮状病毒SB-1A株截短的 VP8＊蛋白原核表达载体 pET28a-SB-1A△VP8＊，将破伤风毒素的通用T细胞表位P2引入重组亚单位蛋白，构建重组载体 pET28a-P2-SB-1A△VP8＊。分别将以上两种重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后经肌肉注射免疫BALB/c小鼠，利用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示， 重组蛋白P2-SB-1A△VP8＊诱导的血清抗体水平显著高于SB-1A△VP8＊，说明P2 可以增强 SB-1A△VP8＊的免疫原性[3]。 基于以上研究报道，本研究将P2、P21-P30-P2、P32-P23-P21-P30-P2 分别与CPB蛋白串联，以期增强β毒素蛋白的免疫原性。

本研究成功构建了含破伤风毒素T细胞表位的产气荚膜梭菌β毒素重组质粒，免疫印迹试验证实了其具有良好的反应原性，至于T细胞表位对β毒素的免疫原性是否有促进作用仍需后续的动物实验来证实。本研究为产气荚膜梭菌重组毒素亚单位疫苗的开发提供了新思路。