1株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及生物学特性研究

宋新宇 ， 张 青 ， 郭莉莉 ， 窦小龙 ， 赵 鹏 ， 郎 枫 ， 范根成

(动物基因工程疫苗国家重点实验室 山东省畜禽动物疫苗重点实验室青岛市畜禽疫苗重点实验室 青岛易邦生物工程有限公司 ， 山东青岛266114)

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)是冠状病毒科的鸡传染性支气管炎病毒属RNA病毒，该病毒基因组具有独特的转录合成机制，再加上自然进化、多株免疫和高密度饲养等客观因素造成野毒和疫苗毒大量长期共存，使得IBV极容易发生点突变、基因缺失、插入以及基因重组等，进而导致IBV不断产生变异，新的血清型和基因型不断出现[1、2]。目前，IBV的血清型已达26种之多，并仍有不断上升的势头。而在实际生产中，免疫失败的现象时有发生，使得传染性支气管炎成为禽病防治中难于控制的“顽症”。因此,研究不同地区IBV的发生、进行血清学鉴定和分子病原学研究，一直是该病研究的焦点，对于从根本上控制传染性支气管炎具有重要意义。生物学特性研究不但对IBV分离株的鉴定提供了一种可靠的诊断方法，而且也是对分离株进一步研究的基础。

为更好地服务市场，本公司一直跟踪研究不同地区IBV的发生情况。本文针对2015年从江苏某疑似传染性支气管炎鸡群分离到的一株传染性支气管炎病毒，进行了初步鉴定及生物学特性研究。

1 材料

1.1 病料 2015年从江苏某疑似传染性支气管炎鸡群无菌采集发病鸡气管、肾脏和腺胃。

1.2 引物 参照GenBank收录的IBV S1基因序列保守区域设计，由上海Invitrogen公司合成。如下所示：

上游引物S1-F∶5′-TATTGATTAGAGATGTTG GG-3′;

下游引物S1-R∶5′-CATAACTAACATAAGGGCAA-3′。

1.3 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒，购自TIANGEN公司；AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶及RNA酶抑制剂，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.4 SPF种蛋 购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.5 SPF鸡 SPF种蛋，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，购回后在公司动物房孵化出雏，负压隔离器内饲养。

1.6 试验场地 青岛易邦生物工程有限公司技术中心及动物房。

2 方法

2.1 病毒的分离 取发病鸡气管、肾脏和腺胃，用无菌生理盐水匀浆制成20%悬液，每毫升加入2 000 IU青霉素、链霉素，反复冻融3次，3 000 r/min离心15 min，取上清除菌后经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚，置37 ℃孵育观察，孵化144 h，收毒。然后按此方法连传5代。

2.2 分离株PCR鉴定及序列分析 取分离株第6代毒进行S1基因的RT-PCR扩增，序列测定与基因CenBank中的IBV序列进行比对和分析。

2.3 分离株毒价测定 将分离株第6代病毒液10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 四个稀释度，每稀释度尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0.1 mL，设同日龄未接种SPF胚5枚作对照，置36 ℃～37 ℃继续孵育，每日照胚2次，剔除24 h以前的死胚，至144 h，取出所有活胚。接种后鸡胚在24～144 h全部或部分死亡，存活鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接毒胎儿比对照最轻胎儿重量低2 g以上)等特异性病痕判为感染，计算EID50。

2.4 无菌检验 取分离毒第6代，按2010年版《中国兽药典》附录[3]进行检验。

2.5 外源病毒检验 取分离毒第6代，按2010年版《中国兽药典》附录[3]进行检验。

2.6 分离株的血凝特性检测 取分离株第6代病毒液先按2010年版《中国兽药典》附录[4]进行血凝效价测定；再将第6代病毒液经2个单位的卵磷脂酶C 37 ℃水浴2 h，检测对鸡红细胞的凝集价，并用分离株的高免血清进行血凝抑制试验。

2.7 分离株的部分理化特性检测

2.7.1 耐热性试验 分离株病毒液56 ℃水浴分别处理30 min，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育观察。

2.7.2 pH值稳定性试验 分离株第6代毒在pH值3.0和pH值12.0环境下室温作用3 h，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育观察。

2.7.3 脂溶剂敏感试验 分离株病毒液经氯仿、乙醚分别处理30 min，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育观察。

2.7.4 胰蛋白酶稳定性试验 分离株第6代毒经1%胰酶37 ℃处理1 h，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚0.2 mL/枚，置37 ℃孵育观察。

2.8 电镜观察 取分离株第6代病毒液，12 000 r/min(4 ℃)离心30 min，取其沉淀用2%磷钨酸染色2 min，电镜观察病毒形态。

2.9 分离株的致病力试验

2.9.1 对不同日龄SPF雏鸡的致病力试验 (1)人工感染试验：用分离株强毒滴鼻104.0EID50/只，分别接种7、21、60日龄SPF鸡，每个日龄10只，同时各日龄设10只不攻毒作空白对照。分别置于负压隔离器中饲养，观察试验鸡的发病情况；(2)病理学观察：对人工感染7、21、60日龄试验发病和死亡的鸡进行系统的剖检，观察各脏器的病理变化；(3)病毒的分离：取人工感染试验发病或死亡鸡的气管、肾脏用无菌生理盐水匀浆成10%悬液，过滤除菌后经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，分离病毒。

2.9.2 最小致病量试验 将分离株病毒液稀释成104.0EID50、103.0EID50、102.0EID50、5×101.0EID50，分别滴鼻接种21日龄SPF鸡，每组10只，隔离饲养，观察试验鸡的生长和发病情况。观察结束后进行剖检，观察各脏器的病理变化。分组及接种情况见表1。

表1 鸡传染性支气管炎病毒分离株不同接种剂量攻毒分组情况

2.10 免疫原性试验 将灭活的分离株病毒液与白油佐剂按1∶ 2比例制备油苗，以0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL剂量免疫21日龄SPF鸡各10只，肌肉注射。同时设同条件未免疫对照鸡10只。免疫后21 d用分离株滴鼻攻毒，104.0EID50/只，攻毒后观察14 d，记录发病情况。

3 结果

3.1 病毒分离结果 将采集到的病料处理后接种10日龄SPF鸡胚，盲传6代，到第6代部分鸡胚出现早期死亡，死亡鸡胚全身出血明显，未死鸡胚发育受阻，呈明显的侏儒胚、蜷缩胚变化；各代尿囊液HA效价呈阴性。

3.2 分离株S1基因RT-PCR扩增及分子进化树分析结果 分离株S1基因RT- PCR扩增可见到清晰的1.7 kb左右大小的条带，与引物设计的预期结果相符。从进化树看，分离株属于当前IBV主要流行的QX型。序列比对结果见图1。

3.3 分离株毒价测定 取分离株第6代毒种测定病毒含量，结果显示，分离株第6代病毒含量为106.1EID50/0.1 mL。

3.4 无菌检验结果 按2010年版《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

图1 分离株与GenBank中收录的IB毒株S1基因分子进化树

3.5 外源病毒检验结果

3.5.1 鸡胚检查法

3.5.1.1 尿囊腔途径 鸡胚均10/10存活，取鸡胚液作血凝试验，均为阴性。

3.5.1.2 绒毛尿囊膜途径 鸡胚均10/10存活，胎儿均发育正常，绒毛尿囊膜也无病变；取鸡胚液作血凝试验，均为阴性。

3.5.2 细胞检查法 (1)细胞观察：取2个方瓶(100 mL容量)的鸡胚成纤维细胞(培养24 h左右)，接种病毒血清混合物0.2 mL，培养7 d，细胞均无病变；(2)红细胞吸附试验：结果红细胞均被洗去，无红细胞吸附现象。

3.6 分离株的血凝特性检验结果 按2010年版《中国兽药典》附录方法测定病毒液血凝效价为阴性，用卵磷脂酶C处理后HA为7log2，并能特异性地被分离株的高免血清所抑制。

3.7 理化特性测定结果

3.7.1 耐热性试验结果 56 ℃水浴30 min，分离株毒力几乎不受影响。结果见表2。

3.7.2 pH值稳定性试验结果 在室温下进行，分离株对pH值3和pH值12均有不同程度的耐受力，分离株对pH值3的耐受力比pH值12好。结果见表2。

3.7.3 脂溶剂敏感性试验结果 分离株对乙醚和氯仿均敏感。结果见表2。

3.7.4 胰蛋白酶稳定性试验结果 分离株经胰蛋白酶处理后毒力略有下降。结果见表2。

表2 理化特性测定结果

-：表示测不到

3.8 电镜观察结果 将分离株第6代病毒液电镜

观察均可见到完整的病毒粒子，直径80～120 nm，有囊膜、囊膜表面有纤突，顶部膨大，长约20 nm，突起末端呈球状，整个突起呈梨状，整个病毒呈皇冠状，未见非目的病毒。见图2。

图2 分离株病毒液负染后经电镜观察可见到典型的冠状病毒

3.9 分离株毒力试验结果

3.9.1 对不同日龄SPF雏鸡的致病力试验结果

3.9.1.1 人工感染试验结果 用分离株第6代病毒液接种7、21、60日龄SPF鸡，接种后3～5日开始发病，先出现呼吸异常，拉稀，精神差，渐进性消瘦、死亡。见表3。

表3 分离株攻毒后发病死亡统计

3.9.1.2 剖检病变观察结果 7、21、60日龄SPF鸡攻毒后病死鸡的剖检病理变化基本相同。肾脏肿大，有尿酸盐沉积(呈花斑肾)，输尿管、泄殖腔有尿酸盐沉积；气管有不同程度的出血，有黏液；肺脏不同程度出血；个别腺胃肿胀，腔上囊肿胀。对照鸡无明显变化。

3.9.1.3 病毒的分离结果 人工感染试验中采集发病或死亡鸡的气管、肾脏组织制成悬液，在10日龄SPF鸡胚中盲传两代，接种病毒后144 h可见明显的侏儒胚、蜷曲胚。

3.9.2 分离株最小致病量试验结果 用不同剂量分离株第6代毒分别接种21日龄SPF鸡。结果显示，不同剂量分离株攻击21日龄SPF鸡，104.0EID50攻击10/10发病，6/10死亡；103.0EID50攻击10/10发病，4/10死亡；102.0EID50攻击8/10发病，3/10死亡；5×101.0EID50攻击6/10发病，1/10死亡。发病鸡临床主要表现为精神沉郁、采食下降、羽毛蓬松、两翅下垂、脱水，爪子发干，拉白色或水样稀便，有不同程度的呼吸道症状、渐进性消瘦、死亡。不同剂量发病死亡鸡病变基本一致，表现为肾脏肿大，有尿酸盐沉积(呈花斑肾)，泄殖腔有尿酸盐；气管环有不同程度的出血，有黏液；个别鸡腺胃肿胀，腔上囊肿胀。结果见表4。

3.10 免疫原性试验结果 分离株灭活苗按不同剂量免疫后，免疫组0.25 mL/只～1.0 mL/只保护8/10～10/10，对照组发病8/10。结果见表5。

4 讨论

4.1 大量的流行病学监测结果显示，近年来国内流行的IBV毒株处于持续不断的进化当中，根据韩宗玺等[4]对1995-2009年共计15年间国内可检索到S1基因全长序列的所有IBV分离株进行的遗传进化分析，结果显示，国内至少同时流行10个以上基因型的IBV毒株，但QX型(也称LX4型)为最主要的优势基因型(54.1%)。根据最近的研究报道，在2009年以后的国内分离株中，QX型毒株所占的比重至少在75%以上[5-8]。QX型原型株QX株最早于1996年分离自青岛某发生腺胃炎的鸡群[9]，但直到2004年该型病毒才被证实在国内广泛流行，临床表现主要为肾病变型[10]；而同期包括俄罗斯、荷兰、比利时、德国、法国等在内的多个欧洲国家也在同一时期发现存在该型毒株的流行，但临床表现主要是与引起“假母鸡”有关[11]。另外张小荣、刘胜旺等人的研究结果，说明2018年流行的IBV也主要是以QX型为主[12-13]。目前国内尚无上市的IBV QX型疫苗。

表4 分离株的最小致病量试验结果

表5 免疫效力试验结果

4.2 为跟踪市场IB流行情况，研制新的疫苗，我们不断从各地分离IBV。本文针对2015年我们从江苏某疑似IB的鸡场分离到一株病毒进行鉴定。结果电镜观察可见直径为80～120 nm，有囊膜和纤突的冠状病毒粒子。分离株对热、酸、碱和胰蛋白酶均有一定的耐受力，对脂溶剂敏感。与贺秀媛等人的研究结果相一致[14]。这符合传染性支气管炎病毒具有囊膜这一特征。

4.3 从进化树分析，该分离株属于当前主要流行的QX型，与张小荣、刘胜旺等[12-13]人的研究结果相一致。我公司跟踪市场调研结果结合张小荣、刘胜旺等人的研究结果分析，IBV当前除主要的QX型外还有HN-08型、LSC/99I型、LDT3/03型、TW-I型、Mass型、CH VI型、TW-II型和793/B型等。说明国内IBV是在不断变异的。

4.4 该分离株致病力结果显示，人工攻毒后，临床能复制出典型的病例，发病鸡主要表现呼吸异常、拉稀、精神差、渐进性消瘦、死亡等。剖检发病鸡肾脏肿大，有尿酸盐沉积(呈花斑肾)，输尿管、泄殖腔有尿酸盐沉积；气管有不同程度的出血，有黏液；肺脏不同程度出血；个别腺胃肿胀，腔上囊肿胀。102.0EID50/只的分离株攻击能达到80%的发病率，因此分离株的最小致病量定为102.0EID50/只。考虑到实际应用中各种因素对病毒的影响，为保证攻毒结果成立，攻毒剂量采用最小致病量的2倍剂量，即为104.0EID50/只。分离株对不同日龄SPF鸡的致病力不同，日龄越小，发病率和死亡率越高。说明该分离株是株致病性比较典型的IBV。

4.5 该分离株免疫原性试验结果显示，分离株灭活疫苗按0.25 mL/只～1.0 mL/只免疫21日龄SPF鸡保护达8/10～10/10，从试验结果看，0.25 mL/只即可达到良好的免疫效果。说明该毒株具有良好的免疫原性。

综合以上试验结果，该分离株即有良好的免疫原性，又能复制出典型病例。说明该毒株是个不错的传染性支气管炎病疫苗候选株。这为后期产品开发奠定了基础。