GC-MS/MS法测定饮用水中2种卤代酸残留量

胡松，陈卢涛，周婷婷，俞璐萍，黎斌，刘小羽，胡晋峰，朱萌萌，*

（1.绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州310000；2.安徽农业大学茶与食品科技学院茶叶生物与利用国家重点实验室，安徽合肥230036）

国内采用氯气消毒是最主要的消毒方式[1]，70年代以来，人们已经发现氯化消毒副产物（disinfection by-products，DBPs）与人类癌症的发生有密切的相关关系，且消毒副产物中卤乙酸含量约占DBPs的50%左右，而二氯乙酸（dichloracetic acid，DCAA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCAA）是饮用水加氯消毒的副产物卤乙酸之一，其具有不易挥发、沸点高、致癌风险大等特点，其中DCAA和TCAA的致癌风险分别是三卤甲烷的50倍和100倍，已被美国国家环境保护局（Environmental Protection Agency，EPA）定义为人类潜在的致癌物[2]。世界各国对饮用水中氯乙酸规定了相应浓度限值，我国GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定DACC、TCAA的含量分别不得超过50、100 μg/L；美国饮用水水质标准中规定卤乙酸总量不得超过60 μg/L；日本规定了DCAA、TCAA的含量分别不得超过30、40 μg/L；澳大利亚规定了DCAA、TCAA的含量分别均不得超过100 μg/L[3]。

目前国内外卤乙酸的检测分析方法主要包括气相色谱法（gas chromatography-hydrogen flame ionization detector，GC-ECD）[4-5]，气相色谱质谱法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）[6-8]，离子色谱法[9-11]，高效液相色谱法[12]，液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[1，13]等。由于卤乙酸具有较强的极性，采用气相法检测通常需要先进行衍生化反应；液相色谱及液相色谱串联质谱法可以无需经过衍生化过程，大大缩短分析时间，但其检出限较高，为0.1 mg/L～1.0 mg/L[14]；离子色谱法具有操作简单，测定迅速等优点，但该方法灵敏度低[3]。近年来，许多研究人员在前处理方法上进行各种改进，优化，或采用固相微萃取方式对卤乙酸进行富集，但效果不太明显。刘天洁[4]采用硫酸-甲醇溶液结合GC-ECD对DACC、TCAA的前处理过程进行优化，最终衍生条件为60℃烘箱衍生90 min，缩短了反应时间。三甲基硅重氮甲烷（trimethylsilyl diazomethane，TMS-CHN2） 是重氮甲烷的安全性替代物，已广泛被应用于苯氧羧酸类除草剂、酚类化合物[15]的衍生化反应上。本文拟采用优化后的TMS-CHN2衍生化前处理方法结合气相色谱-串联质谱 （gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）方法，探讨两种衍生化试剂用于生活饮用水中二氯乙酸、三氯乙酸残留量分析的差异，旨在探究一种操作简单、快捷高效、检出限低的前处理及衍生化方法，用于饮用水中痕量二氯乙酸、三氯乙酸残留量的检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二氯乙酸、三氯乙酸标准品：1 000 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；三甲基硅重氮甲烷（TMSCHN2、纯度≥96.0%）、2.0 mol/L己烷溶液：上海麦克林生化科技有限公司；甲醇：色谱纯，美国J.T.Baker公司；浓硫酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；甲基叔丁基醚：≥99.0%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；碳酸氢钠、氯化铵、无水硫酸钠：上海安谱实验科技股份有限公司；试验所用水均为去离子水；微孔有机滤膜：0.22 μm；棕色带聚四氟乙烯衬垫的螺口塞采样瓶；娃哈哈纯净水、屈臣氏蒸馏水：市售。

1.2 仪器与设备

气相色谱-串联质谱仪：GC-2010 plus气相色谱仪配TQ8040质谱仪，DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），日本 Shimadzu公司；MTN-5800 氮吹仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；CHK-121台式精密酸度计：北京昌科仪自动化科技有限公司；ST-16R离心机：美国Thermo Fisher公司；BSA2202S电子天平：德国Sartorius公司；talboys数显型漩涡混合器：美国Henry Troemner公司；V-700型旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司；KQ5200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

进样口温度：200℃；载气：高纯氦气；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999%；柱流量：1.2 mL/min；进样方式：不分流进样，1.0 min 后开阀；进样量：1 μL；定量方法：外标法；升温程序：40℃保持1 min，以9℃/min升至130℃，以40℃/min升至150℃，保持3 min；

1.3.2 质谱条件

色谱-质谱接口温度：200℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；检测器电压：0.99 kV（+0.4 kV）；测定方式：多重反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）；定性、定量离子、碰撞能量等参数见表1。

表1 二氯乙酸、三氯乙酸质谱检测参数Table 1 The MS/MS parameters of dichloracetic acid and trichloroacetic acid

1.4 试验步骤

1.4.1 提取

采集到的水样，使用棕色的带聚四氟乙烯衬垫的螺口塞采样瓶于4℃冰箱中保存。量取25.00 mL水样于50 mL离心管中，加入2.0 mL浓硫酸（调节pH≤0.5），摇匀后，再加入10.0 g无水硫酸钠，涡旋1.0 min，加入5.0 mL甲基叔丁基醚，涡旋器振荡5.0 min，静置30 min待有机相和水相分层，移取有机相至10 mL具塞刻度管中，缓缓氮气吹至近干，待衍生。

1.4.2 衍生化

1）向上述提取液中加入硫酸-甲醇溶液（体积比，20∶80）2.0 mL，盖上瓶塞，在50℃水浴条件下反应2.0 h，取出具塞刻度管并冷却至室温，逐滴加入2.0 mL饱和碳酸氢钠溶液以中和pH，加入1.0 mL甲基叔丁醚，涡旋1.0 min，取有机相过0.22 μm滤膜并转移至样品小瓶，待净化[16]。

2）向上述提取液中加入衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷（TMS-CHN2）40μL，盖上瓶塞，涡旋1.0min，在30℃水浴条件下反应20.0 min，加入1.00 mL甲基叔丁基醚提取衍生后产物，涡旋后离心取上清液，待净化。

1.4.3 净化

先用5.0 mL正己烷预淋洗Florisil固相萃取柱，将上述待净化液转移至小柱上，再用10.0 mL甲基叔丁基醚溶液进行洗脱，收集全部流出液，在常温条件下氮气流吹至近干，用正己烷溶解并定容至1.0 mL，供气相色谱-串联质谱检测。

1.4.4 标准溶液的配制

称取二氯乙酸、三氯乙酸1.00 mL，用甲基叔丁基醚定容至25.0 mL，得到40.0 mg/L标准储备溶液；用甲基叔丁基醚稀释为5.00 mg/L的标准工作溶液，于0℃～4℃保存。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱条件的优化

在电子轰击离子源（electron bombardment ion source，EI）检测模式下对二氯乙酸、三氯乙酸甲酯后产物进行一级质谱分析（Q3 Scan），在质谱图中选择质荷比较大，绝对强度较大的离子为前体离子；设定3eV～45 eV（每3 eV一个间隔）的碰撞能量，对选定的前体离子峰进行二级质谱分析（产物离子扫描），根据二级质谱图，选择离子强度最大的为定量离子，离子强度次之的为定性离子。图1为使用优化后的气相色谱质谱条件采集二氯乙酸（2.00 mg/L）、三氯乙酸（2.00 mg/L）标准溶液MRM质谱图。

图1 二氯乙酸、三氯乙酸MRM色谱图Fig.1 Chromatogram of dichloracetic acid and trichloroacetic acid in multiple reactions monitoring mode（MRM）

2.2 三甲基硅重氮甲烷（TMS-CHN2）衍生条件优化

二氯乙酸、三氯乙酸具有较高的沸点（＞190℃）和一定的极性，在水中难挥发且强酸性和极性会引起在色谱柱上吸附，通常需要衍生化反应后再进行气相色谱质谱分析，本试验比较了两种衍生化试剂：硫酸-甲醇溶液和TMS-CHN2己烷溶液对二氯乙酸、三氯乙酸两种卤代酸衍生化反应的效率和适宜性。

2.2.1 TMS-CHN2添加量考察

在具塞玻璃离心管中分别加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸两种标准储备液0.400 mL，添加衍生化试剂 TMS-CHN2己烷溶液体积分别为 20、40、60、80、100 μL，在室温条件下，氮气流缓缓吹干有机溶剂，按照1.4.2中第二种衍生化方法进行衍生，并将最终体积定容为1.0 mL上机分析。结果表明（见图2），随着TMS-CHN2添加量的增加，二氯乙酸、三氯乙酸衍生化产物响应逐渐提高，当添加量增加到40 μL时，衍生化产物响应最高。继续增加TMS-CHN2己烷溶液的添加量，衍生化产物的响应呈稳定趋势。综合考虑，为保证衍生化反应完全，同时可以有效降低试验成本，选择TMS-CHN2己烷溶液的添加体积为40 μL。

图2 TMS-CHN2添加量对衍生化效率的影响Fig.2 The effects of the additives of TMS-CHN2on the derivatization

2.2.2 衍生化时间的考察

在具塞玻璃离心管中分别加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸两种标准储备液0.400 mL，添加优化后的衍生化试剂TMS-CHN2己烷溶液体积40 μL，在室温条件下，氮气流缓缓吹干有机溶剂，按照1.4.2中第二种衍生化方法进行衍生，分别设置衍生化时间为10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 min，并将最终体积定容为 1.0 mL上机分析。结果表明（见图3），随着衍生化时间的延长，衍生后产物的响应逐渐增强；当衍生化时间为20.0 min时，衍生后产物响应最高；当继续延长衍生化时间，衍生化产物响应稍有降低。综合考虑，为保证衍生化产物响应，同时可以有效节约试验时间，选择TMS-CHN2己烷溶液衍生化时间为20.0 min。

图3 不同衍生时间对衍生化效率的影响Fig.3 The effect of different derivative time on derivative efficiency

2.2.3 衍生化时间的考察

在优化好的衍生试剂添加量（40 μL）及衍生时间（20.0 min）基础上，对衍生化温度进行考察。在具塞玻璃离心管中分别加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸两种标准储备液0.400 mL，添加优化后的衍生化试剂TMS-CHN2己烷溶液体积40 μL，在室温条件下，氮气流缓缓吹干有机溶剂，按照1.4.2中第二种衍生化方法进行衍生，分别设置衍生化温度为20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0℃，并将最终体积定容为1.0 mL上机分析。结果表明（见图4），从20℃开始，随着水浴温度的提高，两种卤代酸的响应逐渐增强，在30℃时响应最强。水浴温度逐渐升高，两种卤代酸的响应快速降低，由于正己烷沸点较低，在40℃及以上温度时，可明显看到具塞刻度管上层有明显黄色气体，可能由于正己烷的挥发带动TMS-CHN2与样品接触较少，衍生化反应不完全导致，因此，选择TMS-CHN2己烷溶液的最佳衍生化温度为30℃。

图4 不同衍生温度对衍生化效率的影响Fig.4 The effect of different derivative temperature on derivative efficiency

2.3 硫酸-甲醇溶液和TMS-CHN2两种衍生化试剂比较

参照GB/T 5750.10-2006《生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标》及李志华等优化后的硫酸甲醇溶液衍生条件（即1.4.2），确定TMS-CHN2最佳添加量及衍生化时间的条件后，比较两种衍生化试剂在最佳添加量下对相同浓度的二氯乙酸、三氯乙酸衍生化效率。在具塞玻璃离心管中分别加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸两种标准储备液0.400 mL，在室温条件下，氮气流缓缓吹干有机溶剂，分别按照1.4.2中1）和2）的衍生化方法进行衍生化反应。结果表明（见图5），在相同的仪器分析条件下，二氯乙酸经TMS-CHN2衍生后的响应是经硫酸-甲醇溶液衍生后响应的1.69倍，三氯乙酸经TMS-CHN2己烷溶液衍生后的响应是经硫酸-甲醇溶液衍生后响应的1.71倍。烷基化试剂主要由重氮甲烷、烷基卤、醇类等组成，其中重氮甲烷使用最广泛，且反应迅速、高效、无副产物，但其毒性大，不易保存，现经常被TMS-CHN2所代替，TMS-CHN2是重氮甲烷的安全性替代物，已广泛被应用于苯氧羧酸类除草剂、酚类化合物的衍生化反应上。两种衍生化试剂经比较可发现，TMS-CHN2己烷溶液在二氯乙酸、三氯乙酸的衍生化反应上，较常规硫酸-甲醇溶液衍生时间更短、衍生试剂量更少，衍生产物响应更高，操作也更为方便、简单，可以替代硫酸-甲醇溶液用于二氯乙酸、三氯乙酸的检测。

图5 两种衍生化试剂比较（n=3）Fig.5 The comparison of two derivatization reagents（n=3）

2.4 方法的线性范围、加标回收率、精密度和定量限

分别取5.0 mg/L二氯乙酸、三氯乙酸混合溶液25、50、100、200、500、1 000 μL 于 25 mL 容量瓶中，分别用纯净水定容至25.0 mL，配制后工作曲线的质量浓度分别为：5.0、10.0、20.0、40.0、100、200 μg/L。按 1.4 的方法进行萃取、衍生、分析，按优化色谱条件进样1 μL，以峰面积为纵坐标，标准样品的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，其线性回归方程及相关系数见表2，以信噪比S/N≥3估算仪器的检出限（limit of determination，LOD），S/N≥10估算仪器的定量限（limit of quantitation，LOQ），结果见表 2。

表2 二氯乙酸、三氯乙酸化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficient，limit of determination（LOD）and limit of quantitation（LOQ）of dichloracetic acid and trichloroacetic acid

分别量取自来水、娃哈哈纯净水、屈臣氏蒸馏水3个样品25.0 mL，分别添加0.02、0.04、0.1 mg/L不同水平的二氯乙酸、三氯乙酸标准溶液进行回收率试验，每个添加水平重复3次，加标回收结果见表3。

二氯乙酸、三氯乙酸的平均回收率范围为86.1%～96.5%，相对标准偏差小于5.2%，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F中对检测方法确认的要求。

3 结论

本试验第一次建立了三甲基硅重氮甲烷（TMSCHN2）结合气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）用于二氯乙酸、三氯乙酸衍生化反应的检测方法，比较了硫酸-甲醇溶液、三甲基硅重氮甲烷（TMS-CHN2）两种衍生化试剂用于二氯乙酸、三氯乙酸衍生化反应的优劣。两种试剂均可用于二氯乙酸、三氯乙酸的衍生化反应检测，TMS-CHN2己烷溶液在二氯乙酸、三氯乙酸的衍生化反应上，将衍生化反应时间从120 min缩短为20 min，较常规硫酸-甲醇溶液衍生时间更短、衍生试剂量更少，衍生产物响应更高，且添加回收试验结果精密度更高，操作也更为方便、简单。采用优化后的GC-MS/MS方法，在空白样品添加浓度为0.02、0.04、0.1 mg/L的范围内，二氯乙酸、三氯乙酸的平均回收率范围为86.1%～96.5%，相对标准偏差小于5.2%，符合GB/T 27404-2008附录F中对检测方法确认的要求。因此优化后的该方法检出限低、灵敏度高，适用于生活饮用水中二氯乙酸、三氯乙酸定量检测。

表3 二氯乙酸、三氯乙酸化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=3）Table 3 Recoveries and RSD of dichloracetic acid and trichloroacetic acid in cabbage and citrus（n=3）