rDNA-ITS序列在吸血蠓分子鉴定中的应用研究*

王崇财 陈 敏 杨美琼 潘林奇 云小云 黄恩炯**

(1.海南国际旅行卫生保健中心，海南海口 570100； 2.福建国际旅行卫生保健中心，福建福州 350001)

吸血蠓(Biting midges)是医学昆虫的重要类群之一，在昆虫分类系统中属双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)。蠓的分类研究距今约有260年历史，形成了较为成熟的分类体系，但由于其中存在许多具有多处相似特征的隐种(cryptic species)组成的复合体(complex)或种团(group)，仅依靠传统的形态学特征往往难以进行准确的分类鉴定。因此，寻找可靠的分类鉴定方法，以期快速、准确地识别蠓科昆虫，尤其是吸血蠓，是现代昆虫分类学家研究的重要内容之一，也是蠓传疾病防控工作的基础。

rDNA广泛分布于各种生物细胞中，在功能上具有高度的保守性和良好的时钟性，其测定序列常用于物种分类和生物间系统发育的研究，尤其是物种的种间分类研究(Dover，1982；Hillisetal., 1988；Hillisetal., 1991)。ITS是位于rDNA上18S和28S基因之间的区域片段，包括ITS1和ITS2两段序列，由于该区域不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度较其他区域快，具有种内变异小而种间变异大的特性，加上协同进化作用保证了该片段在基因组不同单元间的一致性，因而适合进行各种分子操作，是较理想的种间鉴定和系统发育分析的遗传标志(Paskewitzetal., 1993; Kuhlsetal., 2005; Lietal., 2008; Niuetal., 2008)。近年来，国内外对ITS序列标记在蠓科昆虫中的研究和应用越来越多， ITS1和ITS2序列已在蠓类昆虫的鉴定中发挥了重要的作用，在一定程度上促进了蠓的分类鉴定水平(王飞鹏等，2012)。本研究采用rDNA-ITS(包括ITS1和ITS2基因)对常见库蠓进行分子鉴定研究，探讨rDNA-ITS序列在吸血蠓分子鉴定中的适用性，以期初步建立吸血蠓类分子鉴定技术体系，为吸血蠓的快速鉴定及外来有害生物的识别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验标本

本研究共选用采集自福建、海南、广西、黑龙江、新疆5个省份的59个样品。标本均用95%乙醇浸泡保存，实验材料均取自蠓的胸段组织。同时，从GenBank下载13个库蠓基因序列，共计24种库蠓。详细信息见表1。

1.2 ITS基因PCR扩增

采用昆虫基因组DNA提取试剂盒(Insect gDNAMinipre Kit)提取蠓DNA。扩增引物参考Perrinetal. (2006)以及Gomulskietal. (2006) 文献：PanCulF 5′-G T A G G T G A A C C T G C G G A A GG-3′, 28S 5′-A T T T G G G G G T A G T C A C A C AT-3′，引物由上海生工公司合成。PCR反应体系：模板10 μL，上下游引物各1 μL，2×MasterMix 25 μL，加ddH2O至总体积50 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 60 s，54℃ 60 s，72℃ 60 s，30个循环；72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，在浓度为1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE。电泳结束后于DNR BIO-Imaging Systems公司MiniBis凝胶成像仪中观察、拍照并记录结果。

表1 标本信息Tab.1 Information of tested specimen

表1(续)Tab.lContinued

种类Species标本编号Species No.采集地Collection site采集日期Collection date刺螫库蠓Culicoides punctatusC. punctatus_1福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-25C. punctatus_2福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-25C. punctatus_3福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-25C. punctatus_4福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_5福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_6福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_7福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_8黑龙江逊克Xunke, Heilongjiang2012-08-01C. punctatus_9黑龙江逊克Xunke, Heilongjiang2012-08-01C. punctatus_10黑龙江逊克Xunke, Heilongjiang2012-08-01C. punctatus_giAB462275-曲囊库蠓Culicoides puncticollisC. puncticollis_1新疆阿拉山口Alashankou, Xinjiang2012-08-22C. puncticollis_2新疆阿拉山口Alashankou, Xinjiang2012-08-22琉球库蠓 Culicoides actoniC. actoni_giAB462259-短跗库蠓 Culicoides brevitarsisC. brevitarsis_giAB462261-多孔库蠓 Culicoides cylindratusC. cylindratus_giAB462268-残肢库蠓 Culicoides imicolaC. imicola_giAF074019-条带库蠓 Culicoides maculatusC. maculatus_giAB462263-苏格兰库蠓 Culicoides scoticusC. scoticus_giJF280793-累赘库蠓 Culicoides verbosusC. verbosus_giAB462281-和田库蠓 Culicoides wadaiC. wadai_giAB462264-北域细蠓 Leptoconops borealisLeptoconops borealis青海格尔木Ge 'ermu, Qinghai2014-06-05

1.3 扩增产物的纯化与基因测序

采用OMEGA凝胶回收试剂盒(E. Z. N.A. Gel Extraction Kit-200 Preps)对本实验中的所有样品进行切胶回收、纯化以及分子克隆，将克隆子转接试管液体培养基中培养，保存并送测序。每个菌液样品由上海生工生物工程有限公司测序，所有的样品均双向测序。

1.4 序列分析与系统发育分析

用DNAMAN、BioEdit、Clustal W、MEGA、TNT、MrBayes等软件进行序列分析并构建系统进化树。

2 结果

2.1 ITS基因的序列特征

本研究共获得16种常见库蠓59条ITS基因序列。将所得序列与GenBank收录的库蠓基因序列进行同源性比对。结果表明测序获得序列与GenBank上相同拉丁学名蠓种的基因序列相似性均达99.8%以上，证明其确为同一蠓种。共计24种库蠓72条序列经多序列比对后用于分析的序列总长度为917 bp(不含引物)。MEGA的统计结果表明，其中有326个保守位点，566个可变位点，484个简约信息位点，82个单态位点。T、C、A、G的平均含量分别为：33.95%、14.77%、32.20%、19.08%，A+T的含量(66.15%)明显高于C+G的含量(33.85%)。转换明显低于颠换，转换/颠换平均值为0.74。

2.2 遗传距离

应用MEGA计算不同库蠓种内与种间的遗传距离。采用的方法为K2P双参数模型(Kimura 2-Parameter Model)，对空位两两删除(Pairwise deletion)。结果显示，不同库蠓的种内遗传距离为0～0.13，平均距离为0.07；种间遗传距离0.05～0.39，平均遗传距离为0.25(表2)。

2.3 系统发育

对本实验所用24种库蠓进行系统发育研究，选取北域细蠓Leptoconopsborealis作为外群。在系统发育分析前，对本实验ITS数据集进行饱和性检测，结果显示在转换和颠换上都不存在饱和，该数据集适于系统发育分析(图1)。

图1 ITS转换颠换数与F84距离的关系Fig.1 Relationship between transition and transversion and F84 distances 转换值；v 颠换值。s Transition；v Transversion.

本实验采用Neighbor-joining (NJ)邻接法、Maximum Pasimony (MP)简约法和Bayesian (BI) 贝叶斯法分别构建NJ树(图2)、MP树(图3)、BI树(图4)。NJ树由MEGA构建，方法采用基于K2P核苷酸替代模型，Bootstrap法1000次自展进行检验。利用TNT软件构建MP树。贝叶斯法利用jModelTest测验核苷酸替代模型，基于BIC原则(Bayesian Information Criterion)选择最佳模型HKY+G，位点速率变异设置为γ分布，同时建立4个马尔科夫链，以随机树为起始树，每100代抽样1次，直至分列频率平均标准偏差小于0.01后停止运算。

从结果可以看出，三种算法的的拓扑结构基本相似，表明所有的实验标本的系统发育结果较为稳定和可靠。仅以NJ法为主叙述其系统发育关系。从NJ法系统发育树的聚类结果可以看出，同个亚属的不同种类都先聚类在一起，共有7个亚属，形成2大分支。分别为包含有二囊亚属Avaritia、屋室亚属Oecacta、单囊亚属Monoculicoides、库蠓亚属Culicoides的18个库蠓种组成的分支Ⅰ；以及包含有三囊亚属Trithecoides、傲蠓亚属Fastus和带纹亚属Beltranmyis的分支Ⅱ。在分支Ⅰ中，二囊亚属与屋室亚属和单囊亚属s关系最近，与库蠓亚属关系最远；屋室亚属和单囊亚属为姐妹群。在分支Ⅱ中，傲蠓亚属和带纹亚属为姐妹群，与三囊亚属形成并系群。由树型上显示，大部分蠓种的种内同源性均相当高，且各自形成单系群，但也有几处的使得这些种类形成并系群，分别是灰黑库蠓C.pulicarlis_3和C.pulicarlis_5脱离于其他灰黑库蠓复合组，而与外群的亲缘关系最近；C.pulicarlis_7落于带纹亚属中的荒川库蠓和环斑库蠓之间；C.brevipalpis_1落于傲蠓亚属Fastus和带纹亚属之间。

图2 基于ITS基因构建的NJ树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS genes by Neighbor-Joining

图3 基于ITS基因构建的MP树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS genes by Maximum Parsimony

图4 基于ITS基因构建的BI树Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS genes by Bayesian Inference

3 讨论

本研究以福建、海南等省常见库蠓为研究对象，构建了基于ITS基因的库蠓分子鉴定体系。24种库蠓的种间遗传距离为0.05～0.39，平均遗传距离0.25；种内遗传距离为0～0.13，平均遗传距离0.07。种间遗传距离为种内遗传距离的3.57倍，表明ITS具有较大的种间甚至种内变异性，是特异检测系统的理想靶标基因，提示了基于ITS基因的分子标记可以用于库蠓的种类鉴定，具有一定的应用前景。

从系统发育的结果可以看出，本研究所得的同一亚属的不同蠓种优于不同亚属蠓种聚类于同一分支，这与遗传距离分析中种间平均距离远大于种内平均距离的结果相符；不过，在支系Ⅰ中，多孔库蠓和累赘库蠓为姐妹群，没有与同亚属的蠓种聚类在一起，而与标翅库蠓形成并系群，但由于标本数量有限且2个标本均来自GenBank，无法查验标本，其准确的分类地位还有待进一步讨论。除了同个亚属的蠓种能够较为准确的聚类，绝大多数库蠓的种内同源性也都较高，在发育树上各自形成单系群且有较高的置信值(图2)，这与遗传距离分析中种内遗传差距仅为0.071的结果相符。这些结果都从分子生物学角度验证了形态分类学结果，也验证了真核生物ITS序列具有高度变异性的特点，在物种进化和遗传关系研究中具有重要的价值。

尽管本研究中采用ITS单基因标记对灰黑库蠓的鉴定结果不甚理想，这可能是由于ITS变异速度快，种内基因变异大的原因所致，且灰黑库蠓复合组一直是困扰国际蠓科分类学者的重要难题(Lassenetal., 2012)，大的种内变异亦暗示着隐存种存在的可能(Gomulskietal., 2006; Pagesetal., 2009)。分子系统发育分析的结果与形态学分类的结果存在偏差，固然与所选序列片段存在局限性有关，形态鉴别特征的不科学或者是主观性也可能是造成这种混乱的原因之一。

当今，国内外学者对吸血蠓的分子分类已做了大量研究工作，都仍处研究阶段，各种分子分类应用的靶标基因有优点也存在其一定的局限性。核糖体DNA上的ITS区域序列进化速度快，在物种水平上变异较大，序列多态性强并含有足量的遗传信息，已被广泛用于物种分类及系统进化研究，但是这些基因中存在大量的插入和缺失现象，从而使序列比对受到障碍、不便操作，而且还容易造成错误的比对(Liuetal.，2010)。基于线粒体基因编码的DNA条形码技术及其应用前景虽被众多学者所看好，但也有学者认为如此短的DNA片段不能提供物种水平的可靠信息,完全依靠DNA条形码会导致鉴定错误(Willetal., 2004; Ebachetal., 2005)。因此，在利用任何一个基因或多个基因片段进行物种分类和种属鉴定时,不能只考虑所选用标记基因的片段长度，而应该结合样本来源、鉴定者、序列组成及其同源性等综合评价。

今后，在形态学分类的基础上，应该着力探索、尝试新的分子标记及多个分子标记相结合，多层次、多方面、系统地研究吸血蠓分类，可较大程度地解决传统形态学分类方法的缺陷，更为“真实”地反映吸血蠓的种群进化和亲缘关系。