库蠓属6亚属翅形变化分析与亲缘关系

甯 媛，段 琛，常琼琼，侯晓晖

(遵义医科大学 基础医学院，贵州 遵义563000)

库蠓属(CulicoidesLatreille)隶属于双翅目(Diptera)、蠓科(Ceratopogonidae)，是蠓科中最大的属，也是最重要的吸血蠓。目前，全世界的吸血蠓已知4属1 671种，其中库蠓1 415种，而我国已知吸血蠓有3属475种[1]，其中库蠓可达350种[2-5]。库蠓不仅嗜吸食人畜血液，而且传播牛羊蓝舌病、非洲马瘟等，是国际上重要虫媒病毒的生物载体[6-8]。近10年来，蠓作为蓝舌病等传染病暴发流行的生物媒介，给欧洲牲畜贸易带来了重大影响，造成了巨大的经济损失，现已成为欧洲各国应用昆虫学研究的热点。正确地识别病媒在传播疾病的风险评估至关重要，因此，库蠓的分类与防治成为蠓科昆虫研究的关键。目前，对库蠓的分类主要利用其口器、触须、翅斑、尾器等外部形态特征作为依据，但由于库蠓体型微小、种类繁多，部分库蠓近似种仅依靠形态学方法很难区分，且迄今为止仍有许多种类无法归属到任一亚属。因此，需要开发更多的新技术、新方法实现蠓虫的分类鉴定，如分子或数字化形态学工具，以便可靠地对近似物种进行区分[9-11]。

几何形态学(geometric morphometric)是一种研究二维或三维地标位置变化的形态统计分析方法，它通过对形状特征进行定量描述和分析，能准确直观地描述不同生物体种内与种间微小的形状差异[12]，被逐渐引入昆虫分类学研究中。昆虫的翅膀形态在自然界中具有很高的遗传性，而且它们基本上是二维的，容易测量、易于识别。自1893年康斯托克首次将昆虫翅膀脉序用于传统分类以来，越来越多学者开始在系统发育研究中使用昆虫的翅，尤其是二维形态计量学[13]。目前，几何形态学已成为有效的辅助工具，被国内外学者广泛运用于膜翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等多个类群的昆虫研究[14-20]。虽然几何形态学在国外的蠓类分类研究中已有应用[21-23]，但国内应用仅见本课题组的相关研究[24]。

我国库蠓现分属于12个亚属，但有一部分种类无法归属于任何亚属。本研究以库蠓6亚属即带纹亚属(Beltranmyia)、二囊亚属(Avaritia)、库蠓亚属(Culicoides)、屋室亚属(Oecacta)、三囊亚属(Trithecoides)、单囊亚属(Monoculicodie)为研究对象，运用几何形态学计量分析法对库蠓翅的大小与形态变化进行分析，探讨其亚属间亲缘关系，为库蠓的分类和进化研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 库蠓标本

本实验所用标本采自贵州、辽宁、西藏、内蒙古等省区，选用翅面无褶皱且完整的6亚属、20种、雄性库蠓标本共63张，所取标本与编号见表1。

1.1.2 仪器与试剂

OLYMPUS(SZ61)光学体视显微镜、LEICA(DM2500)光学显微镜与Canon DS照相机分别为日本OLYMPUS公司、德国LEICA公司和日本OLYMPUS公司生产。75%乙醇、无水乙醇、二甲苯、氢氧化钠均为国产分析纯，中性树胶购于上海懿洋仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 翅图像采集与地标点提取

首先采集库蠓翅的图像，然后使用TpsUtil软件进行格式转换。再利用TpsDig2.16软件对每张翅图进行人工标点，共标记10个地标点(图1)，所得数据保存为TPS文件。

1.2.2 普氏叠加

表1 标本信息Table 1 Information of specimens in this study

续表1

Arc，弓脉；R，径脉；R-M，径中横脉；M、M1、M2，中脉及其分支；Cu、Cu1、Cu2，肘脉及其分支；r1，径1室。Arc， Arculus; R， Radial vein; R-M， Radial-median crossvein; M， M1 and M2， Medial vein and branches; Cu， Cu1 and Cu2， Cubital vein and branches; r1， First radial cell.图1 库蠓翅的10个地标点(以长缘库蠓C. longirostris为例)Fig.1 Distribution of ten landmarks on the wing of Culicoides longirostris

利用广义普氏分析法(generalized procrustes analysis， GPA)叠加地标构型，其基础是相应地标之间距离的广义最小二乘叠加，使地标点离差最小化，剔除同一坐标体系中非形态因素的影响。使用Morpho J软件包将所得地标点进行普氏叠加。

1.2.3 质心值

为了评价物种翅的大小在鉴别中所起的作用，几何形态学中常使用质心值(centriod size， CS)比较样本间翅的大小。CS是唯一与所有形状变量无关的尺寸测量方法，其灵敏度远远高于常规测量。首先使用PAST 3.0软件计算63种库蠓翅形质心值，然后进行shapiro-Wilk正态分布检测，并通过Leven方差齐性检验，做单因素方差分析(One-way ANOVE)比较库蠓6亚属不同种类翅的大小差异及其显著性。

1.2.4 主成分分析与典型变量分析

在普氏叠加的基础上，利用主成分分析(principal component analysis， PCA)和典型变量分析(Canonical variate analysis， CVA)来评估形状空间的变异性，以及亚属间相似性和鉴别性。CVA通过假设协变量矩阵是相同的，从而找到相对于组内变化而言，组均值最大化的形状值。这是一种有效的分类单元间差异检测方法。平均形状两两差异的统计学意义通过马氏(Mahalanobis)距离的置换试验(1 000次重复)测定，由于形状变化的各向异性(方向依赖)致P值不同，因此这种测试被用来评估显著性。

1.2.5 聚类分析

通过6亚属不同库蠓翅的形态变化平均数据计算出亚属间翅形的普氏距离，再根据普氏距离矩阵进行聚类分析，建立亚属间翅的表型树，比较库蠓属6亚属间的亲缘关系。首先运用tps-Super 32软件计算种的平均形态，再应用tps-Small 1.20软件计算样本间的普氏距离，通过NTsys 2.10e软件运用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)分析普氏距离矩阵，创建表型树。

2 结果与分析

2.1 6亚属间翅的大小差异

库蠓属6亚属不同种类的质心值结果均符合Shapiro-Wilk正态分布，通过Leven方差齐性检验，进行WelchFtest非参数检验比较其翅的大小。结果表明，二囊亚属平均翅形最大，屋室亚属平均翅形最小，大小顺序为：二囊亚属(Avaritia)>三囊亚属(Trithecoides)>B带纹亚属(eltranmyia)>库蠓亚属(Culicoides)>单囊亚属(Monoculicodie)>屋室亚属(Oecacta)，但差异不显著(F=156.7，df=11，P=1.961>0.05)。

2.2 6亚属间翅的形态变异

对库蠓属6亚属不同种类的翅进行主成分分析，共产生16个主成分(PC)，其中PC1(73.648%)和PC2(12.372%)占总变异量的86.020%，可以解释库蠓属6亚属翅的主要差异，为了可视化，差异结果通过网格图形式展现(图2)。由图2可知，在PC1轴上，翅的变异主要发生径2室与翅基部(标点3和10)，径2室呈外展趋势，而翅基部呈缩小趋势；在PC2轴上，翅的变异主要发生在径中横脉、径1室、径2室内(标点1～3、7和8)，以及翅基部到肘1脉端部的区域(标点9到10)，径中横脉、径1室、径2室内呈缩小趋势，而中4室、翅基部呈现出外展的趋势。由此可知，库蠓属6亚属翅的差异主要集中于径中横脉、翅基部、径1室、径2室和中4室。此外，对库蠓属6亚属不同种类的翅进行典型变量分析，由CVA散点图(图3)可知，同一亚属的种类基本聚在一起，不同亚属间基本无交叉。同时，通过库蠓属6亚属翅的马氏距离及其P值比较表(表2)可知，三囊亚属和单囊亚属间的马氏距离最大，达9.476 3，即两者间的翅形差异最大；而带纹亚属和屋室亚属间的马氏距离最小，为4.284 7，即两者间的翅形差异最小。6亚属间库蠓的翅形变异显著，具有统计学意义(P﹤0.05)。

2.3 库蠓属6亚属翅的聚类分析

由图4可知，该表型树分成2大支：库蠓亚属与三囊亚属聚为1支，而其余4亚属聚为一大支；二囊亚属和单囊亚属先后从4亚属的大支中分出来，带纹亚属和屋室亚属聚为1支。说明6亚属中带纹亚属和屋室亚属的亲缘关系最近，三囊亚属与库蠓亚属的亲缘关系次之，单囊亚属与三囊亚属的亲缘关系最远。

图2 六亚属库蠓翅形在PC1和PC2上的形状变化网格图Fig.2 Distribution of wing shape variation in six subgenera along first two PCs

3 讨论

本研究运用几何形学方法对库蠓属6亚属不同种类的翅进行了大小和形态比较分析，质心值分析虽获得了不同亚属库蠓翅的大小顺序，但其统计学分析无显著差异，说明翅的大小不能作为区分亚属的特征依据[25-26]。主成分分析结果中PC1和PC2解释了库蠓6亚属不同种类翅形的主要差异，并通过网格图展示了差异的部位，其差异主要集中于径中横脉、翅基部、径1室、径2室和中4室内，这几个位置可作为鉴别库蠓种类的依据。同时，CVA结果中散点图和Mahalanobis距离均提示库蠓6亚属不同种类的翅形有显著差异，利用翅形能成功鉴别出亚属及其不同物种，这与国内外学者利用几何形态学在库蠓、按蚊、实蝇等方面获得的研究成果一致[27-30]。此外，聚类分析的结果与CVA结果一致，即6亚属中带纹亚属与屋室亚属的亲缘关系最近，而三囊亚属和库蠓亚属与其他4亚属亲缘关系较远。上述结果虽依据不同种类库蠓的翅形变化，但分类结果却与各亚属形态分类有一定的相似性，如带纹亚属和屋室亚属均为两复眼分离、触须第三节有感觉器窝；较近的二囊亚属与带纹亚属和屋室亚属有一定区别，即两复眼连接、第三节触须有感觉器窝；较远的库蠓亚属和三囊亚属则形态特征区别最大，两者皆为两复眼连接、第三节触须无感觉器窝。本研究表明，几何形态学计量法能够作为一种有效的辅助工具应用于蠓科的分类研究中，并且可用于探讨亚属间亲缘关系，但由于自然界中存在普遍的协同进化现象，其结果能否准确地反映物种之间的系统发育关系还需结合分子生物学等多种数据进行综合分析。

与传统分类方法相比，几何形态学具有量化、快速、准确等优点，仅凭借翅脉中的几个重要结合点所形成的几何空间的差异变化就可以快速区分库蠓属的亚属，相对于分子生物学鉴定技术，它具有成本低、可重复性强、输出结果直观等优点。因此，本研究为蠓类分类鉴定工作提供了一个新方法、新思路。但几何形态学在昆虫研究中的应用仍存在一定局限性：(1)存在人为因素的误差，如人工选取地标点、处理图片等；(2)所选取的研究特征不具代表性和全面性，如翅脉特征在亚属的分类和鉴定过程中，具有一定的意义但不能作为唯一或者最重要的鉴定分类特征；(3)几何形态学分析不能处理缺失样本，不完整的样本可供分析的形态信息可能不够充分。

图3 库蠓属6亚属翅形典型变量分析散点图Fig.3 Scatter plots of canonical variate analysis of six subgenera

表2 六亚属间翅的马氏距离及其显著性比较(基于10 000次重复)Table 2 Comparison of six subgenera wing based on the Mahalanobis distance and significant test (based on 10 000 permutation rounds)

图4 基于普氏距离对6亚属库蠓进行聚类分析Fig.4 Phenetic tree of six subgenera wing based on the Procrustes distance