家兔中microRNA的研究进展

邵嘉皓，王 杰，贾先波，陈仕毅，赖松家

(四川农业大学 动物遗传育种研究所 禽畜遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，四川 成都 611130)

microRNA(miRNA)是一类广泛存在于各种生命体中具有调控作用，由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码小RNA。成熟体miRNA 5′端的5～8个核酸序列被称为“种子序列”，能够与靶基因的3′-非翻译区(3′-untranslated regions，3′-UTR)配对，从而在动植物中参与转录后基因表达调控。在脊椎动物中，miRNA的形成经历了从转录、核加工、核输出、到细胞质再加工的过程，最后形成含有23个碱基的单链RNA，该过程需要核糖核酸酶Ⅲ、解旋酶、exportin-5蛋白和RNA聚合酶Ⅱ等的参与。研究表明，miRNA大多由自身的单拷贝或多拷贝基因簇转录而来，具有很高的特异性、保守性和时序性，与卵泡发育、性别形成、细胞周期、宿主—病原体互作和胚胎发育等生命活动密切相关。目前，miRNA研究主要集中在小鼠、猪和家兔等实验动物上面。Li等[1]利用高通量测序技术，在家兔体内共识别464个miRNA前体和886个成熟miRNA。有研究者在獭兔背部和腹部皮肤中发现差异表达的miRNA 211个，在安哥拉长毛兔毛囊周期生长阶段发现差异表达的miRNA 97个，在日本白兔肠道中发现差异表达的miRNA 12个，在初生幼兔和成年兔视网膜中发现差异表达的miRNA 28个[2-5]。这些miRNA在家兔中可能参与调控多种机体生理活动。本文将对miRNA在家兔中的最新研究进行综述，主要包括miRNA与肌肉发育、脂肪代谢和家兔疾病调控3个方面，旨在为家兔遗传育种与繁殖提供理论依据。

1 miRNA的发现与功能

1993年，Lee等[6]在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中发现第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4。线虫细胞中lin-4基因可反向调节lin-14蛋白质的形成，通过定位克隆lin-4基因，发现lin-4基因不编码蛋白质，而是合成2个小的转录本，转录本上包含能与lin-14基因mRNA 3′-UTR互补的序列。2000年，Reinhart等[7]在秀丽新小杆线虫上发现第二个异时性开关基因let-7。let-7基因RNA能与一些靶标基因mRNA的3′-UTR结合，从而调节线虫的发育时序。随着let-7基因的发现，研究者们猜想这种具有调节功能的微小RNA可能具有广泛的功能[8]。2001年10月，《Science》报道了3个实验室分别从线虫、果蝇和人体中发现的几十个类似于lin-4基因的小RNA基因，将其转录的小RNA命名为microRNA(简称miRNA)，并推断其在动物中可调控多种基因表达[9-11]。Lee等[11]运用计算机程序发现秀丽新小杆线虫中miRNA基因数为88个，待检测验证的miRNA基因数不超过35个。此后，随着高通量测序和生物信息技术的发展，成千上万的miRNA在各物种中相继发现，宣告miRNA时代的到来[13-15]。

对于miRNA功能的初步探索源于Lee等[6]发现lin-4基因RNA能与lin-14基因mRNA不完全互补作用而影响lin-14翻译。运用基因分析方法，lin-4和let-7基因RNA被证实分别与lin-28和lin-41基因mRNA的3′UTR存在RNA-RNA互补关系[7，16]。1999年，Olsen等[17]发现，lin-4 RNA通过种子序列与lin-14基因mRNA的3′-UTR结合，可以使lin-14基因正常转录形成mRNA并开始正常的翻译，但是会抑制随后的翻译或蛋白释放等。成熟miRNA被组装到RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非对称RISC复合体，发挥基因调控功能[18-19]。miRNA调节功能由miRNA与其靶标基因mRNA之间的配对程度决定[20]。当miRNA的种子序列与靶标基因mRNA 3′-UTR不完全配对时会抑制翻译；当miRNA通过种子序列与靶标基因mRNA 3′-UTR进行完全互补配对，将导致mRNA切割或降解[21-23]。研究发现，部分miRNA兼具以上2种配对方式，例如let-7转录生成的miRNA。

miRNA广泛存在于动物中，在进化上具有保守性。据统计，线虫中已确定的miRNA基因超过112个，黑腹果蝇中超过148个，而已发现的miRNA基因仅是蛋白编码基因总数的冰山一角[24]。另有研究表明，动物体内存在20%～30%的基因受不同miRNA的调控[25-26]。2003年，bantam miRNA被发现有原癌基因作用[27]。miRNA还可作为触发RNA干扰(RNA interference，RNAi)的分子，在生物体内参与细胞发育等过程。miRNA可广泛参与动物生命活动，具有重要的调节功能。

2 miRNA在家兔肌肉中的研究

肌肉的生长发育主要由肌细胞承担，细胞增殖、分化和凋亡是肌肉发育中重要的生命过程。虽然有关肌肉发育的研究一直是生命科学的热点主题，但是对重要功能基因和调节因子实施精确调控的分子机制和转录后水平的调控网络有待进一步探究。兔肉中富含必需氨基酸和细肌纤维，探究家兔肌肉中miRNA调控机制，对家兔育种和生产具有重要现实意义。研究表明，某些miRNA在肌肉中特异性或优先表达，并且在鱼类、鸟类、哺乳类和圆口类脊椎动物中高度保守，称其为肌相关microRNAs(myomiRs)，包括miR-1、miR-206和miR-133家族等[28-30]。研究发现，miR-208a、miR-208b、miR-486和miR-499具有肌肉组织特异性，且miR-208a仅在心肌中表达。此外，一些myomiRs还具有表达时序性，miR-1与miR-133只在成年动物肌肉组织中高度表达，而在幼年时期基本不表达。在非洲蟾蜍单细胞时期转染人工合成的miR-1会引起胚胎异常发育和心脏形成受阻；过表达miR-133会影响非洲蟾蜍正常发育，但是其影响程度没有miR-1过表达时严重[31]。这些myomiRs通过作用不同的成肌调节因子(myogenic regulatory factors，MRFs)来控制肌肉发育。配对盒基因7(paired box 7，Pax7)是Pax基因家族的一员，能够诱导多种干细胞转化为生肌细胞，促进骨骼肌卫星细胞增殖，同时抑制肌原细胞过早分化。miR-1和miR-206可以靶向抑制Pax7，诱导骨骼肌卫星细胞由增殖转化为分化状态。组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)是肌细胞增强因子2(myocyte enhancer-binding factor 2，MEF2)的转录抑制因子，miR-1通过靶向抑制HDAC4从而促进MEF2表达，正向调节肌细胞分化[32]。miR-133可以介导血清反应因子(serum response factor，SRF)，从而促进成肌细胞的增殖，抑制其分化，而miR-206可通过抑制肌源性转录因子的抑制剂Id1-3和MyoR的表达来促进成肌细胞增殖和分化[33-34]。此外，研究发现miR-1可以靶向HSP60和HSP70基因，在转录后水平抑制蛋白形成，促进心肌细胞凋亡，而miR-133通过抑制靶基因caspase-9的转录与翻译过程而抗心肌细胞凋亡[35]。

随着研究深入，除了肌肉组织特异性myomiRs功能被进一步阐明，一些非肌肉组织特异性miRNA也被发现对家兔肌肉发育起关键作用。张翔宇等[36]借助高通量测序技术发现肉兔胚胎期肌肉组织中长度为23 nt的miRNA比例超过17%，长度为22 nt的miRNA比例达到60%以上，并推测不同禽畜品种及组织间miRNA的作用机制基本一致。在初生新西兰白兔肌肉中高度表达的miRNA比例达到40%，而在84日龄新西兰白兔肌肉中有21%的miRNA也处于高表达状态[37]。Liu等[38]发现，miR-221在84日龄新西兰白兔肝脏中表达量最高，在腿肌中中度表达，并且miR-221在骨骼肌卫星细胞分化过程中表达量先急剧升高，之后缓慢下降，miR-221能促进骨骼肌卫星细胞增殖，抑制骨骼肌卫星细胞分化。此外，MAPK是参与肌细胞发育活动的关键信号通路，可以通过MyoD、Myf5和MEF2家族成肌转录因子促进肌细胞的增殖与分化[39]。刘卜玮等[40]研究表明，miR-222可能通过这些重要信号通路而促进骨骼肌卫星细胞增殖。

3 miRNA在家兔脂肪中的研究

在兔肉产品生产过程中，瘦肉率和肉质风味都与家兔体内的脂肪含量有很大的关系[41]。因此，了解和掌握家兔脂肪的沉积和脂肪细胞的代谢调控机制至关重要。然而，相关miRNA在家兔脂肪组织中的研究相对较少。根据miRNA在物种间具有较高保守性，并且调控功能大多相似，因此其他脊椎动物中miRNA与脂肪代谢相关研究极具参考性。

磷酸酶张力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、CCAAT/增强子结合蛋白家族(CCAAT/enhancer binding protein family,C/EBPs)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,PPARγ)等转录因子是脂肪细胞分化过程中最重要的调控因子，许多脂肪相关miRNA都能与这些调控因子互作来调节脂肪细胞分化。let-7是最早发现在物种间高度保守的miRNA。let-7可以通过靶向调节HMGA2基因的表达而控制脂肪细胞由克隆扩增到终末分化的分化过程[42]。miR-146b是脂肪发育过程中高表达的miRNA，可以与KLF7基因结合抑制前体脂肪细胞增殖，而有效促进其分化[43]。miR-24通过正向调节BMP-2基因的表达从而促进脂肪细胞分化[44]。miR-27家族在脂肪分化过程中表达下调，稳定转染miR-27能够通过阻断PPARγ和C/EBPα基因的表达，从而抑制脂肪细胞的分化[45]。何洪炳等[46]研究发现，miR-130b在家兔前体脂肪细胞分化过程中差异表达。过表达miR-130b后，脂肪细胞分化减慢；抑制表达miR-130b后，脂肪细胞分化加快。作者借助生物信息技术预测miR-130b的靶基因为PPARγ基因，并进一步证实miR-130b靶向PPARγ基因抑制家兔前体脂肪细胞分化。He等[47]还发现，miR-148a-3p在白色脂肪组织生长早期、体外培养的前脂肪细胞分化过程中表达升高，且过表达miR-148a-3p会促进细胞内甘油三酯的沉积，miR-148a-3p直接靶向PTEN基因的3′-UTR区域，参与调控家兔前脂肪细胞分化。

4 miRNA在家兔疾病中的研究

家兔被广泛作为实验材料，在医学、科学研究领域里做出了重大贡献。研究miRNA在家兔模型中的调节机理，对人类疾病临床诊断和治疗提供了新的方向和线索。细胞自主程序性死亡是一个由多种信号途径参与的复杂过程。据报道，miR-101可以与靶基因SOX9的mRNA 3′-UTR互补配对来抑制SOX9蛋白质表达，进一步加快细胞凋亡[48]。miR-155是第一个发现与炎症相关的miRNA，能通过toll样受体(toll-like receptors，TLR)配体、炎性细胞因子和特异性抗原在多个免疫细胞谱系中有效上调[49-50]。随着近年来科学家的不断探索，越来越多的miRNA被证明参与机体炎症反应的调控。miR-25具有多种功能，可影响炎症介质的表达。在兔关节软骨细胞中，WFA可以上调miR-25的表达，继而增加环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表达，引起炎症疾病；沉默miR-25后，COX-2表达降低，揭示miR-25可以影响WFA介导的软骨细胞炎症反应[51]。Zhang等[52]发现，miR-27a mimic转染细胞后可明显降低炎症因子IL-6的表达，基质金属蛋白酶13(matrix metalloprotein 13，MMP13)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白表达水平显著降低，同时miR-27a可以促进软骨细胞的增殖。以上结果表明，miR-27a的上调可通过NF-κB通路有利于骨关节炎症的治疗。其他研究还发现，miR-9通过下调Notch和Bax的表达而激活Bcl-2，最终促进软骨细胞的分化和再生，还通过介导CII表达促进家兔炎症软骨细胞再生[53]。

miR-145过表达可以改变血管平滑肌细胞(smooth muscle cells，VSMCs)的活性，使其从增殖状态转变为收缩状态。Nishio等[54]使用miR-145负载的聚乳酸-糖基乙酸纳米颗粒(PLGA NPs)构建一个简单的体外microRNA传递系统，PLGA NPs局部和持续释放miR-145可使VSMCs处于收缩状态，从而减轻兔内膜增生。He等[55]发现Smad7下调会促进心房纤维化，转染miR-21 inhibitor可显著增加Smad7的表达，并通过双荧光素酶报告系统验证其靶标关系，表明miR-21在心房纤维化中起正向调节作用。阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病。Liu等[56]应用Taq-Man qRT-PCR分析的微阵列技术发现AD疾病家兔模型中miR-125b、miR-98、miR-107、miR-30，以及let-7家族3个成员的变化与人类AD样本相似，同时证实了miR-26b受瘦素调控，瘦素和miR-26b可能参与了胆固醇诱导的AD。Wu等[57]研究表明，miR-92a与KLF2在家兔颅内动脉瘤模型中表达呈负相关，miR-92a可以通过KLF2 mRNA 3′-UTR区域的互补序列直接靶向调节内皮细胞中的KLF2的表达。

5 展望

miRNA作为一种重要的表观遗传物质，是当今分子生物学研究的热点和前沿。miRNA广泛参与细胞增殖分化、炎症调控、脂肪代谢和疾病发生等生理过程，在家兔中发挥着重要的基因调节功能。随着科学技术和生物信息学的发展，越来越多的miRNA在家兔中被发现，其功能也将被验证。但是，目前对miRNA的研究大多处于初级功能验证阶段，尚有许多调节机制以及复杂调节网络有待进一步探索，仍需要进行大量的基础研究，以期获得更有价值的突破，为进一步研究家兔遗传育种的分子调控机制奠定理论基础，为人类疾病诊断与临床治疗提供新方向。